高效液相色谱-Part9：检测器（3）
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前面两期我们讲了紫外-可见光检测器（UV-Vis），二极管阵列检测器（DAD），示差折光监测器（RID）以及荧光检测器（FLD）这四个检测器。那这一期我们要讲讲剩下的三个检测器。
终于讲到最后的三种检测器了，它们分别是蒸发光散色检测器（ELSD）、电喷雾检测器（CAD）、电化学检测器（ECD）。从名字上看，电喷雾与电化学具有相似性，从原理上看蒸发光散射与电喷雾具有相似性。那么我们就来好好了解它们的相似点与不同点。
蒸发光散色检测器的英文全称是Evaporative Light Scattering Detector，一般我们就直接称呼为ELSD检测器。
蒸发光散射检测器是如何工作的呢？我们从它的名字可以看出一些端倪：第一个是蒸发，蒸发肯定是溶剂的蒸发；第二个是散射，散射应该是溶剂蒸发后残留下来的溶质对光的散射作用。
蒸发光散射检测的原理是，雾化来自液相色谱系统的溶剂，并将产生的液滴夹杂在气流中。然后流动相从液滴中蒸发出来。分析物的挥发性低于流动相时，它作为“干”溶质颗粒留在气流中并流到 ELSD 检测器中。到达检测器后，颗粒使光束发生散射。散射光的量可以测量出来，并且与洗脱物质的浓度有关。
Note: 因为流动相需要被蒸发，所以使用的流动相中就不能有不易挥发的物质。比如说：磷酸钠，磷酸钾，醋酸钠，醋酸钾这些属于不挥发的盐类；醋酸铵，三氟乙酸，甲酸铵就具有挥发性。所以使用时一定要注意。（质谱的流动相也需要使用挥发性的物质）
继续往下讲之前我们需要先了解一下：散射。
散射是指由传播介质的不均匀性引起的光线向四周射去的现象。可能存在的散射方式有三种，分别是：Rayleigh散射（瑞利散射），Mie 散射（米氏散射），折射-反射式散射（既有折射又有反射的散射是什么鬼？）。
图一：散射的三种方式
那么是何种散射是如何区分的呢？
如果喷雾器产生的液滴平均直径为 D0，则所得干燥分析物颗粒的平均直径为
D = D0(c ⁄ p)1/3
其中
D0 = 平均液滴直径
c = 分析物浓度
p = 干燥分析物的密度
对于任何给定分析物的峰，ELSD检测器的响应都可以是这三种光散射方式中的一种。光散射的类型取决于进入光束内颗粒的大小。颗粒直径 D与入射光波长 (λ)间的比值，定义了产生的散射类型。
• 瑞利散射出现的条件为最小颗粒（其中D/λ<0.1）。颗粒的散射光与D6成正比，因此散射信号与c2成正比。
• 米氏散射出现的条件为颗粒 D/λ>0.1，但 D/λ<1.0。散射光与D4成正比，而散射信号与c4/3成正比。
• 折射-反射式散射出现的条件为颗粒 D/λ>1.0。散射光与D2成正比，而散射信号与c2/3成正比。
• 当色谱峰从色谱柱上洗脱时，它代表的分析物浓度发生变化。浓度从基线处的接近于零上升到最大值，然后从最高水平返回到接近于零处。如果浓度足够高，则干燥分析物颗粒直径的差异会很大，以至于能适用所有三种散射方式–瑞利，米氏和折射-反射式散射。正是这种差异造成 ELSD检测的校正曲线并非完全线性且有多个数量级。
背景知识介绍完现进入正题，讲讲ELSD的检测过程。
ELSD检测器的三个单独区域为雾化区、退溶区和检测区。所有ELSD检测器都含有这三个区域，使其能够雾化色谱排出液，并蒸发流动相以使只有分析物的干溶质颗粒进入光源以进行散射。
在检测器的雾化区内，色谱排出液被转换为精细的悬浮微粒。同心管或流型喷雾器将色谱排出液和载气（如氮气）相混合，产生一系列形成悬浮颗粒的小液滴并进入一个窄口漂移管。
同心气流喷雾器可以控制载气流和色谱排出液流速。气流越高产生的液滴越小，蒸发溶剂所需的热量越少。相反，气流越低产生的液滴越大，蒸发溶剂所需的热量越多。
在蒸发区内，流动相被蒸发并冷凝，在漂移管中只留下干燥的溶质颗粒。
离开雾化器的雾滴通过漂移管时会变小。载气会将干燥的雾化溶质颗粒带到仪器的检测区。蒸发与时间、载气的温度和压力等因素有关。最好使用沸点和粘度都很低的溶剂。它们包括最常使用的流动相：水、乙腈、甲醇和乙醇。粘性和高沸点的溶剂可能在开始检测之前无法从分析物分子或核素中完全分离出来。这会增加背景噪音并降低分析物的信号响应值，从而导致检测灵敏度（校正曲线的斜率）降低和检测限(LOD)过高。蒸发的溶剂会被冷凝并被捕获进溶剂曲管中排出，几乎所有蒸汽都能经曲管排出。不过，可能会有少量的残留，它们应该排入通风橱以防窜入实验室内。
图二：雾化区和漂移管
分析物颗粒进入检测区域并接受光源的照射。这样光会被散射并聚焦到光电倍增管 (PMT)以测量其强度。
分析物颗粒的大小（直径）决定光如何散射。检测器测量的是相对于激发光束60°处的散射光强度，以尽量消除极化效应和漫射光的影响。不同大小的颗粒有不同的散射光角分布，且不同大小和形状的颗粒有着不同的光散射横截面。通常，较大的颗粒会散射更多的光，产生更强的信号和峰响应。
光电倍增管(PMT)能将散射光信号转换为可以记录和分析的电压信号。散射越强，则ELSD检测色谱上显示的最终信号越强。此散射光只是用色谱峰粗略地测量材料的质量。在一定程度上，这种“质量”响应可与组成无关。然而，许多因素也能影响质量响应，尤其是干燥的小颗粒分析物的密度。还应记住 ELSD检测器的输出与分析物的分子量之间没有直接关系。
一些基本原理都介绍完了，现在我们来看看蒸发光散射检测器的具体一些流程。
图三：蒸发光散射检测器原理图
检测过程描述如下：
1. 洗脱液从色谱柱流入喷雾器，在喷雾器中持续供应的气体将其转化为精细的悬浮微粒。请小心控制气流和流速以确定悬浮微粒内洗脱液液滴的大小。
2. 液滴在蒸发漂移管内被蒸发，只有悬在空气中的上升颗粒和蒸发的溶剂会进入到光散射室的中心。
3. 两个聚光透镜（L1和L2）将灯光聚到狭缝处。
4. 透镜 L3能将光从狭缝中继到散射室中心。狭缝与中继透镜间的挡板使到达散射室的漫射光最少。
5. 只有与入射光相对成 60°角的散射光才能穿过出口到达集光透镜L4。出口的设计及其摆放位置加上两块遮光板的辅助，使能够检测到的漫射光减到最少。第一个遮光板处装配有光电二极管，能通过监测光强度变化而截取一部分漫射的入射光。第二个遮光板能减少与集光方向相反的漫射光。
6. 集光透镜能将光线聚焦到反射镜M1以更改光线的方向，最终使光线反射到光电倍增管（PMT）。
7. PMT 将光转换为电信号。
8. 排出剩余的气态排出液。
此检测器在分析时，能检测出与流动相相比完全不挥发的所有化合物。要检测对UV/Vis几乎没有响应且对质谱仪不能很好电离的化合物，可使用ELSD检测器，它可以分析糖类、抗生素、抗病毒剂、生物分子和天然产品。但请注意，曲线不是线性的，因为 ELSD检测器的响应是非线性的。
ELSD检测在等度和梯度洗脱时运行良好，可以应用多种流动相和添加剂(挥发性)。与折射率检测器相比， ELSD检测器对流动相成分的变化和温度波动不太敏感，但与折射率检测器拥有同样的响应能力。
电喷雾检测器的英文全称是Charged Aerosol Detector，一般我们就直接称呼为CAD检测器。
同样，我们也来看看电喷雾检测器是如何工作的呢？我们从它的名字可以看出内容：第一个是电，使待检测的物质带点，好像质谱检测器；第二个是喷雾，雾化有点像上面的蒸发光散射检测器。
液相流出的洗脱液进入电喷雾检测器后先受氮气作用在雾化室中雾化，再以较高流速撞击到碰撞挡板上，撞击后形成大小不同的外面包裹着流动相的分析物颗粒的液滴，较大的液滴在重力影响下由废液管排出，较小的液滴则随氮气流入干燥管，挥发掉表面溶剂。同时，入口氮气的另一流路则经过电晕装置（含高压铂金电极）形成带正电荷的氮气粒子，与干燥后的溶质颗粒在碰撞室中发生碰撞，碰撞过程中正电荷被转移到颗粒的外表面上，颗粒表面积越大，携带的电荷数越多。另外，为了消除由带有过多正电荷的氮气引起的背景噪音，在带电分析物颗粒气流流入采集器之前，会通过一种称之为离子阱的装置（带有低负电压）定向中和掉迁移率较大的颗粒（即体积小的氮气粒子）上的电荷，而迁移率较小的带电颗粒（分析物颗粒）则把它们的电荷转移给采集器里的捕集网，而后由一个高灵敏度的静电检测计测量出总的电信号。也就是说，图谱里的响应值与测得的电信号呈正比，电信号与被测物的表面积呈正比，被测物的表面积与被测物的大小呈正比，而被测物的大小又与被测物进样的质量呈正比，即电喷雾检测器是一个质量敏感型检测器，其检测的响应值由进样的绝对质量决定，进样质量越大，打碎成的颗粒越大，带电荷越多，响应值越高。因此，无论何种化合物，只要进样质量相同，得到的响应值都趋于一致，这也是其具有一致的响应性的原因。又由于被测物在打碎时无论是离子还是分子都会形成中性的颗粒，且电荷只加在颗粒外表面，所以在一个实验中可以同时检测中性及阴阳离子，而在此之前的检测器都难以实现，也因此成为电喷雾检测器的又一亮点。另外，电喷雾检测器的参数大都已在出厂时设定好，每次分析的条件固定，因此重现性良好，一般RSD<2% 。
可以简单的理解为一下三个步骤：
1. 电喷雾检测器将洗脱液雾化成液滴，然后干燥成颗粒。颗粒的大小随着被分析物的含量而增加。
2. 溶质颗粒与带正电荷的氮气相撞，电荷随之转移到颗粒上–溶质颗粒越大，带电越多。
3. 溶质颗粒把它们的电荷转移给收集器，通过高灵敏度的静电计测出溶质颗粒的带电量，由此产生的信号电流与溶质的含量成正比。
下图，可以更好地帮助我们理解电喷雾检测器的整个过程。
图四：电喷雾检测器原理图
看了以上对电喷雾检测器的工作原理的描述，你是不是觉得它既像蒸发光散射检测器又像质谱检测，它好像两者的结合体，所以电喷雾检测器就会有两者（ELSD, MS）的缺点。首先，由于被测物需要打碎成颗粒再干燥，所以挥发性的化合物无法进行检测；其次，所有基于气溶胶方法的分析仪器的浓度和峰面积均为非线性，包括蒸发光散射检测器和质谱在内，在实际计算中可能不如紫外检测器方便。尽管如此，电喷雾检测器仍不失为一款性能优越的通用型检测器，成为紫外和质谱等检测器的有力补充。
电化学检测器的英文全称是Electrochemical Detector，一般我们就直接称呼为ECD检测器。
通过名字我们可以了解到，它是通过物质的电化学性质来检测物质的。
什么是电化学？我们看看《仪器分析》关于电化学分析法是怎么说的。
电化学分析法是应用电化学的基本原理和实验技术，依据物质的电化学性质来测定物质组成及含量的分析方法。电化学直接通过测定溶液中电流、电位、电导、电荷量等各种物理量，在溶液中有电流或无电流流动的情况下，来研究、确定参与的化学物质的量。依据过程所测定的电参数的不同可分别命名各种电化学分析方法，如电位法、电导法及伏安法等。
来源：仪器分析-第二章-电化学分析法
电化学检测器（ECD）是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的。电化学检测器的原理是电化学反应，即氧化还原反应，通过转移电子形成的电流来对电活性物质进行检测。电化学检测器是利用具有氧化还原性质（或处理后具有氧化还原性质）物质，在电解池中分解产生电流，而电流大小和物质的量成线性关系。服从法拉第定律。其原理依据涅恩斯特方程、菲克第一、第二定律。在液相色谱中对那些没有紫外吸收或不能发出荧光但具有电活性的物质，可采用电化学检测法。
电化学检测器主要有安培、极谱、库仑和电导检测器四种。前三种统称为伏安检测器，以测量电解电流的大小为基础，后者则以测量液体的电阻变化为根据。其中，以安培检测器的应用最为广泛。此外，属于电化学检测器的，还有依据测量流出物电容量变化的电容检测器，依据测量电池电动势大小的电位检测器。另外，按照测量参数的不同，电化学检测器又可分为两类，即测量溶液整体性质的检测器，包括电导和电容检测器；和测量溶质组分性质的检测器，包括安培、极谱、库仑和电位检测器。一般来说，前者通用性强，而后者具有较高的灵敏度和选择性。
由于小编对于电化学检测器接触较少（几乎没有），就说说以上这些基本的电化学原理，不在各位老师面前班门弄斧！
没有买卖就没有杀害！
没有比较就没有伤害！
图五：通用型检测器性能对比
液相色谱仪常用检测器主要分为选择性检测器和通用型检测器，其中选择性检测器包括紫外/可见光吸收检测器（UVD）、二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器（FLD）等，通用型检测器主要指示差折光检测器（RID）、蒸发光散射检测器（ELSD）、质谱检测器（MS）等。
紫外吸收检测器是目前液相色谱仪中应用最广泛的检测器，它灵敏度高，线性范围宽，但要求被检测样品组分有紫外吸收或衍生后有紫外吸收，属于选择性检测器；二极管阵列检测器是紫外检测器的一个分支，是一种光学多通道检测器，它可以对每个洗脱组分进行光谱扫描，经计算机处理后，得到光谱和色谱结合的三维图谱；
荧光检测器同样属于选择性检测器，其灵敏度在目前常用液相色谱仪检测器中是最高的，但要求目标化合物受激发光作用后，能产生发射光，主要适用于能激发荧光的化合物或衍生后能激发荧光的化合物。
通用型检测器中，示差折光检测器是一种早期的测定无生色基团化合物的检测器，只要被测组分与洗脱液的折光指数有差别就可使用，其灵敏度较低，对温度变化敏感，并与梯度洗脱不相容；
蒸发光散射检测器，是20世纪80年代才研发生产出来的，主要用于检测挥发性低于流动相的样品，而不需要样品含有发色基团，它的响应值与样品的质量成正比，灵敏度比示差折光检测器高，对温度变化不敏感，基线稳定，可用于梯度洗脱，但由于灵敏度和重现性差，使得其应用受到影响；
质谱检测器是另一种通用型检测器，在灵敏度、选择性、通用性及化合物的分子量和结构信息的提供等方面都有突出的优点，但它的昂贵操作费用和复杂性限制了它的推广应用。
近年来，一款新型的检测器-电喷雾检测器（CAD）在液相色谱分析中得到了较好的应用，它属于通用型检测器，是一种新型原理的、高灵敏度、重现性较好的检测器，它基于雾化检测器的原理，洗脱液经雾化后形成颗粒，经过漂移管干燥后与带电氮气碰撞，使得目标化合物带上正电荷，最后，通过静电计测量电荷的量，该测量值与目标化合物的质量成一定比例关系。电喷雾检测器基于独特的新型设计原理，解决了其他检测器设计与原理上的一些局限性，它的检测技术完全不依赖于化合物的分子结构，达到了通用性目的，能对大多数化合物提供一致响应性，同时能达到较高的灵敏度和低检测极限，很容易检测到纳克数量级的化合物，并且与液相色谱分离系统联用，其重现性、稳定性很好，因此能准确的用于定量分析或半定量分析，能检测到大部分非挥发性和半挥发性的有机物。
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