2015年在美国成立的Gritstone Bio拥有自复制mRNA和腺病毒两种技术平台，其独特的腺病毒初免+自复制mRNA（SAM）疫苗加强方案已应用于个体化新抗原肿瘤疫苗（NCT03639714）以及通用型新抗原肿瘤疫苗I/II期临床试验（NCT03953235），并展示出良好的安全性及诱导强大T细胞反应的能力。2022年6月7日，Gristone在Nature
communication上发表了其自复制新冠mRNA疫苗的临床前试验结果，题目为：Low-dose self-amplifying mRNA COVID-19
vaccine drives strong protective immunity in non-human primates against
SARS-CoV-2 infection。该疫苗编码武汉株SARS-CoV-2的融合前稳定化的S糖蛋白，采用了黑猩猩腺病毒ChAd68载体疫苗和自复制mRNA两种技术制备疫苗，疫苗接种方案有两种：1、两剂SAM；2、腺病毒+SAM。研究结果显示接种低剂量SAM就能够在小鼠和恒河猴体内诱导很强的体液和细胞免疫反应。采用同一疫苗初免-加强免疫策略，3、10、30ug三个剂量组在接种2剂后均能在恒河猴体内诱导很强的中和抗体（nAb）滴度。10ug剂量组的抗体几何平均滴度（GMT）较恢复者血清高48倍，各剂量组中都观察到了S蛋白特异性T细胞反应。恒河猴试验结果中两种接种方案诱导的S特异性IgG滴度相近，T细胞反应强度也接近，但单剂ChAd免疫诱导了更高的S特异性TH1偏向的T细胞反应，且单剂ChAd免疫后所有猴子都检测到了特异性S中和抗体。无论是同种疫苗初免-加强还是用ChAd初免、SAM mRNA疫苗加强都能够对SARS-CoV-2 病毒攻毒具有保护效应，表现为上下呼吸道病毒复制减少。动物试验中似乎两种方案难分高下，但因为腺病毒和自复制mRNA载体中都编码来源于病毒的蛋白成分，都可能诱导出针对载体本身的抗体反应，所以能否多次使用一直是人们关切的问题。为了避免机体产生针对病毒蛋白的抗体并因此影响疫苗效果，异源疫苗方案似乎更有优势。其他机构已经发表的两项腺病毒初免+mRNA加强的临床试验结果显示，腺病毒（阿斯利康ChAdOx1）初免+mRNA疫苗（BNT162b2）加强方案在诱导体液免疫方面明显优于同源腺病毒2次接种ChAd/ChAd（EudraCT number,2021 - 000683 - 30）【1】，除了诱导对原始毒株的中和抗体以外，ChAd/BNT方案还能够诱导对B.1.351的中和抗体，而在ChAd/ChAd组没有观察到同样的结果，说明mRNA疫苗具有更广谱的预防效果。但是，似乎mRNA疫苗（BNT162b2）+腺病毒（阿斯利康ChAdOx1）方案在诱导抗体和中和抗体方面却远不如同源mRNA疫苗2剂方案（ISRCTN, 69254139）【2】。在S蛋白特异性IgG水平和假病毒中和抗体方面比较，BNT/BNT > ChAd/BNT > BNT/ChAd > ChAd/ChAd,另外值得关注的是ChAd/BNT方案对于细胞免疫的诱导能力要 > BNT/ChAd > BNT/BNT > ChAd/ChAd方案，说明ChAd/BNT方案可能更适合于需要强化细胞免疫的应用，比如癌症疫苗等。这应该也是Gritstone将这一方案用于开发新抗原肿瘤疫苗和HIV疫苗的原因。对于新冠疫苗来说，预防感染和预防重症同样重要，根据既往的临床数据来看，我们推测腺病毒+SAM异源初免/加强方案可能在预防重症方面会有更多优势。不过由于阿斯利康腺病毒新冠疫苗接种后发现了免疫血栓性血小板减少症这一罕见但严重的不良反应【3,4】，使黑猩猩腺病毒载体疫苗在传染病预防中的大规模应用前景变得不再乐观。目前，Gritstone的腺病毒+SAM异源初免/加强方案目前正在美国开展临床试验(NCT04776317)，两剂自复制mRNA方案也将由CEPI赞助在南非开展临床试验。希望在临床试验结束后，Gritstone能够找到更优的疫苗接种方案。但很遗憾这两项试验不是同时同地进行，对于疫苗效果的比较恐怕比较困难。
mRNA疫苗和腺病毒疫苗都使用Wuhan-Hu-1株 (MN908947)全长S蛋白。研究者首先对S基因序列做了密码子优化，选出蛋白表达量高能诱导高滴度抗体且更强T细胞反应的优化序列V2。接着在序列中引入了furin切除位点突变(FurinΔ) 和S2 区域的proline (P) 替换(2P: K986P, V987P)，得到F2P突变体，F2P不易被切割成小片段，可保持在融合前的稳定状态。使用了pUC02-VEE载体和改造后的黑猩猩腺病毒68(ChAd68)载体。mRNA合成使用了修饰核苷酸以减轻天然免疫反应。为脂质纳米颗粒（LNP），使用自组装工艺进行包封，包封率>95%.含有5 mM Tris (pH 8.0),10% sucrose和10% maltose。图3 S序列的密码子优化增强了抗原在体外表达以及小鼠体内的免疫反应
采用同源(SAM/SAM)和异源(ChAd/SAM)两种免疫方案，在小鼠体内评价了优化后的Spike(V2)-F2P ChAd和SAM 疫苗的免疫效果，两种方案中，初免疫苗都产生了针对S蛋白上多个表位的广谱S特异性T细胞反应，SAM加强针后T细胞反应进一步增强(异源增强了2.5倍，同源增强了5.2倍)，T细胞反应主要是CD8+并偏向于TH1 。SAM加强针后S特异性中和抗体滴度也增加了(异源增加了36倍，同源增加了22倍)，说明和单次免疫相比，无论是同源还是异源的加强针都能显著增加疫苗的免疫原性。结果如图2所示。免疫小鼠用剂量范围为0.0001-10ug。低剂量即可诱导强大的免疫反应，诱导的T细胞免疫具有剂量依赖性。如图4所示。图5 Balb/c 小鼠中疫苗诱导偏向TH1的T细胞免疫反应图6 Balb/c 小鼠中SAM疫苗诱导的T细胞免疫反应具有剂量依赖性使用脾细胞IFNγ ELISpot方法评估SAM疫苗免疫后2W的T细胞免疫反应每组5只恒河猴，SAM-Spike(V2)-F2P免疫2次，间隔4周，剂量3, 10, 或 30μg。SAM单次免疫后在一些猴子血清中检测到Spike S1特异性IgG，具有剂量依赖性，二次免疫后所有猴子血清中抗体水平均增加，剂量为30, 10 和 3μg时，GMT分别为 8880, 13,145以及 1223。两剂免疫后所有剂量组都检测到S特异性T细胞反应且显著高于对照组。所有动物在加强针后1周都检测到强的IFN-γ及极低的IL-4反应，表明T细胞反应具有TH1偏向性。第2剂SAM免疫后，通过假病毒中和试验(PNA)和活病毒微量中和试验(MNA) 检测到了强的中和抗体滴度，两种试验结果具有相关性。30 和10μg剂量组nAb水平相近。MNA检测结果分别为 GMT 2180 和 2590 。剂量降低到3ug组，nAb滴度也下降，但可以检出，MNA结果为GMT 245。在所有剂量组均检测到强中和抗体，高于以前报道的能够保护SARS-CoV-2感染的中和抗体水平。
值得注意的是，SAM≤10μg剂量时，血清中IFNα水平不增加，但在30μg 剂量时能够检出，表明SAM在低剂量时不会强烈激活天然免疫反应。在ChAd/SAM方案中， (5× 1011 VP ChAd 初免，30μg SAM 加强, 间隔6周). 加强针后观察到的S特异IgG滴度增加了2.5倍，与两针SAM类似(10 或 30μg) 。单剂ChAd免疫后诱导了更高的S特异性TH1偏向的T细胞反应，说明ChAd疫苗能够快速增加 T-cell反应，两剂后T细胞反应强度与两针SAM接近。单剂ChAd免疫后所有NHP都检测到了S特异性中和抗体，SAM加强后增加了2.3倍。
同源免疫组在2次SAM免疫后1个月，进行攻毒。异源免疫组在单剂ChAd免疫后 6周或SAM加强后4周进行攻毒。和以前的恒河猴的攻毒试验一样，疫苗组和对照组的猴子都没有出现疾病的临床症状。为了评价疫苗对感染后病毒复制的控制作用，采用PCR的方法检测了支气管肺泡灌洗液(BAL)，口咽拭子及鼻拭子以评估病毒载量。结果显示30ug和10ug组SAM同源和异源加强方案都能完全抑制感染后病毒复制。3ug同源加强组免疫反应轻度降低但也为活病毒感染提供了保护。两剂异源加强免疫较单剂ChAd免疫有更好的保护效果。
2剂3 -30μg低剂量SAM免疫后，10μg单次免疫即诱导了强大的中和抗体，2剂后抗体水平与市售的10倍剂量的mRNA疫苗（100ug）接近，说明SAM可以大大降低疫苗剂量。这与SAM能够在细胞内复制有关，增加了疫苗的半衰期，导致更强更持久的免疫反应。是否诱导天然免疫反应是人们对自复制mRNA疫苗的一个主要担忧，本研究中10ug以下剂量基本检测不到天然免疫反应的激活。这主要是使用修饰核苷酸以及在疫苗开发过程中对各种成分进行优化的结果。另外抗原基因序列的优化能够显著提高疫苗免疫效果。希望优化后的疫苗能够在临床试验中取得好的结果。T细胞在清除病毒感染细胞，减轻疾病严重程度中发挥重要作用。在异源免疫方案中，B细胞缺陷的血液肿瘤COVID-19患者中T细胞反应与患者生存率相关，这些患者接种市售疫苗后体液免疫反应很弱。另外，T细胞免疫对于SARS-CoV-2 突变株可能较抗体有更广谱的保护作用。T细胞记忆也比B细胞记忆更持久。所以能够诱导两种免疫反应对于未来的病毒变异可能提供更持久的保护作用。异源加强接种方案能够诱导更强的T细胞免疫，对于免疫受损者、老人或化疗患者可能是一个更好的选择。
参考文献：
1、Normark J, Vikström L, Gwon YD, et al. Heterologous ChAdOx1 nCoV19 and mRNA1273 vaccination. N Engl J Med 2021;385: 1049–51
2、Liu X, Shaw RH, Stuart ASV, et al. Safety and immunogenicity of heterologous versus homologous primeboost schedules with an adenoviral vectored and mRNA COVID19 vaccine (ComCOV): a singleblind, randomised, noninferiority trial. Lancet 2021; 398: 856–69.
3、Huynh A, et al. Antibody epitopes in vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopaenia. Nature. 2021 Aug;596(7873):565-569. doi: 10.1038/s41586-021-03744-4. Epub 2021 Jul 7.
4、Greinacher A, et al. Insights in ChAdOx1 nCoV-19 vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia. Blood. 2021 Dec 2; 138(22):2256-2268. doi: 10.1182/blood.2021013231.
5、Rappaport AR, et al. Low-dose
self-amplifying mRNA COVID-19 vaccine drives strong protective immunity in
non-human primates against SARS-CoV-2 infection. Nat Commun. 2022 Jun
7;13(1):3289. doi: 10.1038/s41467-022-31005-z.
Gritstone成立于2015年8月，总部位于美国加州 Emeryville，在Cambridge,
Massachusetts 以及加州Pleasanton都有分部。主要专注于肿瘤和传染病免疫治疗。公司于2018年9月在纳斯达克上市。2021年1月，Gritstone与Genevant Sciences签订了一项脂质纳米颗粒（LNP）技术的许可协议，以开发针对SARS-CoV-2的SAM新冠肺炎疫苗。此次合作将结合经过临床验证的Genevant的LNP平台和Gritstone基于SAM新抗原的癌症免疫疗法，目前新冠肺炎疫苗正在进行II期试验。2021年2月，吉利德科学公司（Gilead Sciences）与Gritstone Oncology宣布达成合作、选择和许可协议，共同开发一种基于疫苗的、可以治愈艾滋病的免疫疗法。根据交易条款，吉利德将向Gritstone支付3000万美元的现金和3000万美元的股权投资。还将获得额外的7.25亿美元监管和商业里程碑付款，以及净销售额的分层特许权使用费。此次合作，吉利德将利用Gritstone专有的疫苗初免平台。Gritstone研发了针对多种癌症和传染病的免疫疗法。Gritstone拥有两项关键技术，一种是专有的机器学习平台Gritstone EDGE，该平台可以预测存在于细胞表面的抗原，例如肿瘤细胞或被病毒感染的细胞，第二个关键技术是Gritstone可以利用这些抗原，开发和制造有效免疫疗法的能力。Gritstone的疫苗技术具有利用SAM和腺病毒载体，赋予艾滋病感染者的免疫系统特异性识别和破坏HIV感染细胞的潜力。Gritstone将与吉利德其他合作伙伴关系和内部产品项目一起，推动吉利德不断创新以找到治疗艾滋病的方法，并终结艾滋病的疾病流行。合作的很多技术细节并没有对外公布，但是目前来看很可能将使用Gritstone猿猴免疫缺陷病毒（SIV）衍生的抗原。此次与吉利德合作，同样将使用Gritstone疫苗的技术，该技术将腺病毒载体与自扩增mRNA结合使用，以靶向其正在开发的HIV特异性“抗原”或靶蛋白。除此之外，吉利德还在开发长效的HIV-1衣壳抑制剂Lenacapavir（GS-6207），1期临床研究的最新数据显示，患者在单次900毫克剂量给药后，预期的治疗浓度至少持续6个月。来源：
1.https://baijiahao.baidu.com/s?id=1690631367042664326&wfr=spider&for=pc&searchword=gritstone2. Gritstone bio 官网： https://gritstonebio.com
本期编辑：Henry，微信号healsan。
Hanson临床科研团队，由6位在美国的医生及医学科学家组成；目前在美国主要从事新药研发和临床科研。
作者简介： Palio大叔，来自圭特(北京)医药科技有限公司，圭特医药主要从事mRNA相关技术服务。