实战测评：4D-DIA相比于传统DIA技术的性能优势

景杰学术/原创

前一期，我们系统介绍了新一代定量蛋白质组技术4D-DIA的原理、特性和最新的进展（详情点击：划时代4D-DIA技术，重新定义蛋白质组学分析极限），并且阐释了其相比于传统的DIA技术，在保持了良好定量平行性的基础上，还有如下的优势：

1、灵敏度更高：离子利用率从约20%提高到96%，更适合微量样品检测；

2、可靠性更强：由于4D对齐提供了额外维度的校准信息，能够更准确从DIA的混合谱图中解析出具体的肽段信号；

3、检测深度更高：基于以上两个特性，4D-DIA相比于传统DIA能够更加准确的识别出低丰度的蛋白，进而提高检测到的蛋白数目。

技术测评

那么4D-DIA的这些优势，在具体的实践中到底表现如何呢？我们近期进行了一个实际的对比实验，结果展现出4D-DIA相比于传统DIA，具有“更多、更准”的特点。

实验材料：Hela细胞系

实验平台：传统DIA和4D-DIA分别使用Orbitrap HF-X和timsTOF Pro质谱仪；二者均使用相同的建库方法、质谱时间梯度和搜库软件。

一、检测深度比较

对于“组学”研究而言，首先要实现的是深度覆盖。一个样品能够检测到多少个蛋白，通常是研究者首先关注的性能指标。通过比较实验我们可以看到，在相同条件下，4D-DIA相比于传统DIA无论在蛋白还是肽段的数目上，都具有比较明显的优势，可以提高约15%的水平（图1）。

图1 传统DIA和4D-DIA的蛋白和肽段鉴定数目（三次重复）

二、抗干扰能力和定量可靠性比较

除了检测深度外，蛋白组鉴定和定量的可靠性同样非常关键。毫不夸张的说，如果片面追求检测深度的提高，而以牺牲检测的真实性和可靠性为代价，那么这样的提高也就仅仅是停留在“数字”的层面，而没有太大的实际意义了。

DIA相比于DDA的技术而言，最大的挑战就在于其混合谱图难以可靠解析。在定量的时候，主要依据色谱retention time来进行匹配。但是，由于共洗脱现象的普遍存在，仅仅依靠色谱retention time是不够的，存在很多的干扰信号，而影响了检测结果的准确性（注意：准确性和精确性/平行性是不同的概念，每次检测到的结果可能高度一致，但是未必这就是真实准确的）。而在4D-DIA中，这个问题从根本上得到了很好的解决。，全面提升了DIA检测的准确性和可靠性（图2）。

图2：EVGSHFDDFVTNLIEK肽段在传统DIA（上）和4D-DIA（下）中校正后的色谱图

可以看到上图的传统DIA方法中，存在较高的干扰信号；而在下图4D-DIA方法中，由于引入了新的CCS的数值维度，在对同一个肽段不同离子的匹配过程中可以更加准确，4D-DIA中的信号背景很干净。

综合来说，由于增加了新的维度，4D-DIA相比于传统DIA，不但保持了其优异的定量平行性，而且有更高的检测深度，并且很大程度上解决了检测的可靠性问题。由于具有这些特点，4D-DIA特别适合于大队列的临床样本和农业性状样本的定量蛋白质组学分析。

景杰生物目前独家开展4D-DIA检测服务，相关技术细节和研究方案可联系景杰生物科服热线（400-100-1145）或当地销售工程师咨询。

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