16S单V4区是最佳选择？——引物与测序平台选择大讨论
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类似的情况已经出现过好几次了，微微忍不住要唠叨几句了。
诸君且听我说！
在前篇《漫谈16S的前世今生》中也提到了，可反映细菌亲缘关系的16S基因含有9个可变区。其中V4区是指第四个可变区，一般是指515~806bp这个区域，长度约为290bp。而V3-V4区是指第三和第四两个可变区，一般是指341~805bp这个区域，长度约为460bp。
目前大部分公司和实验室都是采用以下两对引物扩增V4区和V3-V4区。部分公司采用的扩增引物会略有差异，这个区域可能会有几个碱基的出入，但不会有大的变动。16S建库方法可参照前贴《高通量测序DNA样本建库方法（3）：扩增法》。
| Type | Name | Sequences |
|---|---|---|
| V4 | 515F | GTGYCAGCMGCCGCGGTAA |
| V4 | 806R | GGACTACNVGGGTWTCTAA |
| V3-V4 | 341F | CCTACGGGNGGCWGCAG |
| V3-V4 | 805R | GACTACHVGGGTATCTAATCC |
两者啥关系？包含关系啊！
正如下图所示，V3-V4区是16S全长的子集，V4区是V3-V4区的子集。
V3-V4区的长度是单V4区的1.6倍。
长度代表了什么？代表了可用于鉴别物种的信息位点。长度越长，可用于反映细菌亲缘关系的位点数越多。
打个比方，16S就如同人类的指纹，识别16S全长序列就可以把所有的菌区分开来（实际上是做不到的，这个以后再细讲）；V3-V4区就只代表了细菌指纹的一部分，只能识别部分菌；而单V4区就更小了，只是V3-V4区的一部分，它说能识别的菌数量更少。
因此，从准确识别样本中菌群结构的角度，
16S全长 优于 V3-V4区， V3-V4区 优于 单V4区！
此处常见误区（槽点）：有些人会说“V3-V4区也只能分辨一部分菌到种的水平，还是有些分辨不出来的，因此你只测V4区就行了。”
这个逻辑实在太奇怪了，小编忍不住吐槽。按这个逻辑，我1200万像素的手机因为拍不出单反的效果，干脆就扔了算了，换个800万像素的手机? 当然，你价格低也行啊。同等的价位，凭啥我不用1200万像素的手机而选低配的呢？测序同理。同等的价格，V3-V4区分辨率优于单V4区。即使它还有问题解决不了，也不代表我要换用低质量的选择。
16S全长的测序需采用三代测序手段，价格较高，这里不做讨论。只讨论可用二代测序方法实现的单V4区和V3-V4区测序。
从理论上，单V4区和V3-V4区的试剂成本是一致的！
二者都是采用illumina测序平台（Hiseq2500和Miseq）的PE250试剂盒进行双端测序。
然而，实际上却有一定的差别。
首先，Illumina测序平台的测序数据质量是随着长度的延伸而逐渐下降的。
即1~100bp的质量 优于 101~200bp 优于 201~250bp。当测序质量值低于一定程度（一般指Q20），该位点是不能用于分析的，需要切除掉。
因此，illumina下机数据虽然是双端250bp的序列，但真实用于后续分析的序列长度是短于250bp的！
其次，单V4区的长度和V3-V4区的长度是不同的！290bp vs 460bp
因此，单V4区左右两端序列如果要拼接的话只需两侧各150bp就可以搭起来了（150bp+150bp=300bp>290bp）。换言之，即使测序质量较差，测得序列末尾有100bp不能用，单V4区还是可以拼接测通的。
然而，V3-V4区需要两侧至少各230bp的序列才能搭起来！（230+230=460bp）。
也就是说，V3-V4区想测通，需要对测序质量要求非常高，序列末尾只允许有不到20bp的低质量位点！！这对测序实验的要求是非常高的。
再换个说法，同样测5万条序列，不管测的再差，V4区测通是完全没有问题的，99%的序列都是可以用的；但是如果选择V3-V4区，由于尾端质量值低的原因，可能只有50%的序列是可以用的。那么为了得到5万条拼接测通的序列（目前大多数合同都是这么要求的，没有拼接测通的序列无法进行下一步的分析），可能就需要测10万条甚至更多序列才能满足，因此测序成本就大大提高了。
还有一个提高测通效率的方法，就是采用PE300试剂盒。然而，同样会增加测序成本。
一张表综合比较V3-V4区和单V4区：
高中低三档，不同的准确度，不同的成本，根据个人需要，任君选择
V3-V4和单V4区如果是同样的价格，能测V3-V4区，一定测V3-V4区！
如果有人跟你说，单V4区和V3-V4区测序价格一样且结果更好，你可以告诉他“呵呵！”
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