全长扩增子：是时候展示真正的技术了

提起微生物多样性测序，大家第一反应可能就是PE250或PE300二代测序，但是这只能针对细菌16S rDNA和真菌ITS或18S的某一段可变区（如16S V3+V4，16S V4+V5，16SV4，ITS1，ITS2,18S V4等）进行测序，显而易见的问题就是测序读长短。随着三代测序兴起，基于其超长读长的特点，可直接获得全部变异区序列信息，获得真正精确到“种”的分类鉴定！！！全长16S/18S/ITS测序获得全部变异区域序列信息不仅能提高物种鉴定的分辨率，还能提高样本中微生物组成鉴定的精确度，从而更加真实地还原样本中微生物的群落结构。

Pacbio全长微生物多样性原理

三代微生物多样性是基于 PacBio 测序平台，利用单分子实时测序（SMRT Cell）的方法，基于HIFI模式对对单一片段进行多轮测序的方式来提升准确性。由于Pacbio的原始错误为随机错误，可通过获取CCS进行自身纠正，来提升数据的准确性。细菌16S全长约1.5Kb，目前PacBio SequelII测序平台平均酶读长可以达到70 Kb，当测序酶读长达到 8Kb时，就可以满足一条1.5Kb的16S全长纠错5次，所以我们承诺：minPasses≥5，据官方数据，同一片段测序 5 次后，单一Read的准确性至少Q20（99%），同一片段测序10 次后，单一Read的准确性可达Q30（99.9%）。推荐阅读：百迈客携“全长扩增子”同您走进 微生物多样性全长时代

CCS Library 测序原理/循环次数对应单碱基准确率

了解CCS更多信息,查看链接 https://ccs.how/how-does-ccs-work.html

Q

为什么选择全长微生物多样性

二代测序技术主要通过16S rRNA基因的部分序列进行分析，但不同的研究人员对不同细菌的16S rRNA基因区域进行分析，不同高变区短读长扩增子的PCR引物选择会影响推断的群落准确性和某些细菌类群的敏感性，使得微生物组研究很难在全局水平上进行比较，同时由于部分高变区携带的变异信息有限，无法实现种水平的物种注释，因此二代微生物多样性通常在属及属以上的水平进行研究。而三代测序技术能够一次性测到所有高变区，不仅可以避免不同引物带来的偏好性，也为提高微生物群落的分类学分辨率提供了一种新的方法。

1.种水平分辨率高：2019年发表在Nature communications上的文章Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis（推荐阅读：Nature 助力三代全长微生物多样性“种”水平精准注释）说明了16S全长能够提供更好的物种分辨率。该研究从Greengenes数据库中下载了非冗余的全长16S基因序列，使用计算机模拟扩增不同可变区，使用通用的分类方法去计算哪个可变区可以提供准确的种水平物种分类。研究结果发现仅部分可变区在某种程度上可以区分物种，V4区的区分能力最差，使用16S全长则可以将所有的序列注释到具体的物种上；该研究同时发现不同的可变区对物种分类能力存在偏差。

注：b以不同可变区进行模拟测序，结果中不能鉴定到种水平的序列比例；c利用数据库中所有16S rRNA基因序列构建发育树，树分支的颜色代表该分支中不能被鉴定到物种水平的序列的比例；d以99%为聚类阈值，不同可变区测序所获得的OTU数量，虚线代表真实数量。

2.更准确的还原微生物群落：16S全长不仅能够提供更好的物种分辨率,也能更准确的还原样本中微生物群落的构成。发表在ISME上的High-resolution phylogenetic microbial community profiling比较了二代和三代微生物多样性物种鉴定的准确性和覆盖度。本研究通过构建了23种细菌和3种古菌组成的人工菌群，对两种测序平台（PacBio和Miseq）的测序结果进行多样性分析，并通过计算机模拟，比较16S rRNA基因全长序列和单V区序列的物种分辨能力。根据两种平台的测序结果，门水平的菌群组成较为相似，但在更精细的水平存在差异。同时，三代测序的结果显著降低了物种分类信息的不确定性。计算机模拟的结果也表明，短读长的单V区测序可能严重低估某些特定类群的微生物，比如水体样本中参与氮循环和甲烷代谢的物种。基于三代测序的菌群多样性组成谱分析能极大地提升物种分类鉴定的精确性，实现高分辨率检测的同时，也为深入阐释菌群的代谢功能奠定了基础。

注：横轴表示物种，纵轴表示丰度，黑色柱子表示全长16S鉴定准确而V4区测序失真；白色柱子表示V4区鉴定准确而全长16S结果失真。对比可以看出，全长扩增子的覆盖度和准确度更高。

3.单碱基水平的分辨率：16S全长测序还可以鉴定出基因组内16S多拷贝之间的多态性，同时也可以实现对不同菌株的鉴定。2019年发表在Nucleic Acids Research 上的" High-throughput amplicon sequencing of the full-length 16S rRNA gene with single-nucleotide resolution"(推荐阅读：16S rRNA全长测序实现单核苷酸水平分辨率)的文章利用PacBio CCS测序模式与新的DADA2鉴定分析方法，从菌群中鉴定出不同菌种的ASVs（ASVs不同于以往的OTUs，它可以具体到单个的SNP，而不是依据相似度聚类），可以将不同的菌种区分开。该研究首先利用2个mock菌群评估了全长16S rRNA基因扩增子测序方法。菌群1——Zymo mock菌群包含8种进化关系较远的细菌菌株，且每种菌株DNA含量均衡；菌群2——HMP mock 菌群包含20种细菌菌株，具有不同的遗传进化相似度，且rRNA基因频率变化超过3个数量级。然后利用DADA2软件处理长片段扩增子CCS获得精准的ASVs。在这两个数据集中，每个ASV注释到对应的一个属与种，符合mock种群中对应的物种。为了实现所期望的检测出多拷贝16S rRNA基因中存在的变异，根据分类学特点将ASVs划分到注释的菌株中。

图注：Zymo模拟群落中16S rRNA基因扩增子序列变异(ASVs)的丰度。在Zymo模拟群落检测了29种不同的ASVs。根据ASV的分类将其分为模拟群落中8个菌株，每个ASVs对应一个菌株中16S不同拷贝的不同等位基因。

同时作者将DADA2计算方法与在PB扩增子测序数据中应用的两款软件算法mothur和uparse进行比较分析。

所有算法表现得都相当不错，反映了PacBio CCS reads具有高的准确度，但是算法间的差异也是非常明显的。DADA2与uparse具有相当好的鉴定特异性，因为鉴定到的每个ASV or OTU真实存在于模拟种群中。在HMP菌群中，DAD2算法检测到17个菌种，另外两种算法仅检测到16个菌种。DADA2可以区分金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌，然而， mothur与uparse却将这2个菌种划归为同一个OTU。研究结果说明DADA2在全长微生物多样性的菌种鉴定方面将会是一个趋势，并将发挥越来越重要的作用。

Q

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推荐阅读：

全长微生物多样性案例分享

1. 使用全长16S rRNA基因扩增子测序技术对厌氧消化池中的微生物多样性进行高分辨率研究

发表期刊：Water Research

影响因子：9.13

发表时间：2020

研究内容：厌氧消化池（AD）中产甲烷菌种

实验材料：从5个国家不同规模的污水处理厂收集了19个厌氧消化池污泥样本

实验方法：Illumina二代微生物多样性+Pacbio三代全长多样性

研究目的：厌氧消化池（AD）能够将特定微生物群落介导的各种有机化合物转化为甲烷，以进行一系列生物反应。通常，微生物群落可分为发酵细菌，互营细菌和产甲烷古细菌。通常使用Illumina平台通过16S rRNA基因分析来确定参与互营代谢的微生物群落。之前的研究使用Illumina平台揭示了90个不同的全规模厌氧消化池中的微生物群落结构，并表明AD微生物群的组成是由操作驱动的。但是，Illumina测序方法的主要缺点（读长短）限制了其在系统分类中的分辨能力。为了更好的分辨AD中微生物组成，基于全长16S rRNA基因序列，使用PacBio单分子实时（SMRT）测序方法，实现精确到种的鉴定。

研究结果：这项研究证明了使用PacBio Sequel平台进行全长16S rRNA基因扩增子测序，是解决低质量的环境DNA样品的方法。测序结果为鉴定菌种提供了更高的分辨能力，有助于分辨厌氧消化池中微生物的组成。文中重点描述的产甲烷菌种，即Methanosarcina horonobensis, Methanosarcina flavescens，在不同的消化池中占主导地位，体现了全长16S rRNA基因扩增子测序检测精确到种水平。通过基因组数据库的扩展以及测序方法和化学方法的改进，全长测序在混合培养环境和工程样品中的应用将更具前景。

参考文献：Superior resolution characterisation of microbial diversity in anaerobic digesters using full-length 16S rRNA gene amplicon sequencing （推荐阅读：微生物多样性可以这样玩）

2. 胎粪菌群与羊水菌群比母体粪便和阴道菌群具有更多的共同特征

发表期刊：Gut Microbes

影响因子：7.74

发表时间：2020

实验材料：39对母体样品(羊水、粪便、阴道液、唾液)和婴儿首胎粪。

实验方法：Pacbio三代全长多样性

研究目的：在利用PacBio单分子实时循环一致测序技术，探索新生儿胎粪菌群的母体起源。

研究结果：Alpha和beta多样性分析显示了样品类型特异性的微生物群落特征，大多数样本类型以不同代表性属的序列为主(羊水和阴道液微生物群中的乳酸杆菌和弯曲杆菌;胎粪菌群中芽孢杆菌和大肠杆菌/志贺菌;母系粪便微生物中的拟杆菌和粪杆菌;母体唾液菌群中的链球菌和普氏菌)。此外，所有样品类型均鉴定出特定的分类操作单元(OTUs)，胎粪菌群与羊水菌群比母体粪便和阴道菌群具有更多的共同特征。结果表明，胎粪微生物群来自多个母体部位，其中羊水微生物群对胎粪微生物群的起源贡献最大。

参考文献：The meconium microbiota shares more features with the amniotic fluid microbiota than the maternal fecal and vaginal microbiota

3. 用全长16S rRNA基因测序鉴定年轻人牙菌斑中初始定居细菌

发表期刊：Msystems

影响因子：6.633

发表时间：2019

实验材料：74名青年在羟基磷灰石盘上形成的牙菌斑

实验方法：Pacbio三代全长多样性

研究目的：本研究收集了74名青年在羟基磷灰石盘上形成的牙菌斑，并根据16S rRNA基因序列确定了初始定殖群。

研究结果： 21个细菌类群主要参与青年羟基磷灰石盘早期菌斑形成，其中包括几种链球菌和非链球菌，如干燥奈瑟菌/黄烷菌/粘膜和罗氏菌。微生物群组成与龋齿状态无关，在龋齿相关的菌群失调的发生发展中发挥着重要作用的可能是微生物群成熟过程，而不是某些最初定殖的特定细菌种类。

参考文献：Identification of Initial Colonizing Bacteria in Dental Plaques from Young Adults Using Full-Length 16S rRNA Gene Sequencing

4. 三代全长多样性揭示柳枝稷土壤丛枝菌根真菌群落结构

发表期刊：Applied AND Environmental Microbiology

影响因子：4.016

发表时间：2020

研究内容：不同农业管理模式下了解丛枝菌根真菌(AMF)的生物多样性和组成。

实验材料：柳枝稷的三个不同的生产地点，每个地点2种处理方式：不施加氮元素（N-）和施加粒状硝酸铵（N+），每个处理4个重复。

实验方法：Pacbio三代AMF全长多样性

研究目的：利用PacBio单分子测序和扩增子序列变异(ASV)水平的分类分辨率，评估了氮施肥对柳枝稷AMF的影响，探索三个不同生产力位点AMF和柳枝稷产量之间的关系。

研究结果：通过对在威斯康星州柳枝稷的三个生产地点AMF的研究，发现施氮量对柳枝稷AMF的组成和多样性没有一致的影响。此外，本研究中阐明的ASV在理论上代表了柳枝稷土壤中存在的精确、活的基因型。在对AMF物种划分和种内功能多样性缺乏分类共识的情况下，ASVs可作为一致的序列标识，为未来寻求AMF功能和生物地理学的研究以及区域适应AMF接种的生物勘探提供参考。

参考文献：Community Structure of Arbuscular Mycorrhizal Fungi in Soils ofSwitchgrass Harvested for Bioenergy （推荐阅读：全长扩增子测序揭示柳枝稷土壤丛枝菌根真菌群落结构）

5. 2型糖尿病患者肠道微生物群改变与miR-122-5p表达的相关性

发表期刊：Ann Transl Med

影响因子：3.279

发表时间：2020

研究内容：采用miRNA高通量测序技术筛选两组小鼠肠道菌群差异表达的miRNA。

实验材料： 2型糖尿病患者和正常对照组，采集受试者空腹血浆和粪便标本。

实验方法：全长微生物多样性+小RNA测序

研究目的：探讨原发性2型糖尿病(T2DM)患者肠道菌群与循环microRNAs (miRNAs)的相关性，探讨miRNA -肠道菌群串扰网络调控T2DM患者胰岛素信号通路和血糖稳态的可能机制。

研究结果：研究发现了原发性T2DM患者特有的肠道微生物群和miRNA特征。miR-122-5p与肠道细菌细菌呈负相关。粪肠球菌的发现，提示在T2DM发生过程中，miRNA与肠道菌群之间的串链可能通过控制糖代谢关键基因来调控胰岛素分泌和信号转导。

参考文献：Correlation between alterations of gut microbiota and miR-122-5p expression in patients with type 2 diabetes mellitus

6. 基于16S rRNA基因全长测序揭示抗药性和敏感性白纹伊蚊肠道菌群的差异

发表期刊：Microbiologyopen

影响因子：3.142

发表时间：2021

研究内容： 溴氰菊酯抗性和敏感性白纹伊蚊肠道菌群的差异

实验材料：敏感性白纹伊蚊（S型）采用50%致死浓度(LC50)的溴氰菊酯对每一代进行抗药性筛选后获得抗性品系（R型）。

实验方法：Pacbio 16s rRNA基因全长多样性测序

研究目的：白纹伊蚊肠道共生菌在宿主对杀虫剂的抗性中具有潜在的作用，本研究探讨共生细菌与杀虫剂耐药性之间的复杂相互作用。

研究结果：在杀虫剂压力作用下，肠道菌群多样性的增加可能是白纹伊蚊抗药性产生的原因之一。耐药白纹伊蚊中沙雷氏菌(Serratia)和不动杆菌(Acinetobacter)的相对丰度高于敏感菌株，说明这两个属的细菌对宿主对溴氰菊酯的抗性具有积极作用。我们还提出证据表明，全长16S rRNA基因测序技术可以作为研究蚊子肠道菌群的理想方法。

参考文献：Differences in the intestinal microbiota between insecticide resistant and sensitive Aedes albopictus based on full‐length 16S rRNA sequencing.

任何长扩增子区域（全长16S、全长18S、全长ITS、AMF、nifH等二代测序无法测通的）都可以使用三代测序。赶紧扫描下方二维码联系我们吧（有专属福利哦）！

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 文：李汉洲

排版：市场部

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