Mol Psychiatry | 高天明课题组揭示恐惧记忆消退的局部神经网络机制

撰文︱陈翌华

责编︱王思珍

创伤后应激障碍（Posttraumatic Stress Disorder，PTSD）是个体因受到严重的创伤性事件，导致长期持续的身心障碍[1]。流行病学研究发现，一般人群的PTSD终身患病率为5.9%-14.8%[2]，遭受地震等自然灾害后的发病率高达23.66%[3]。此外，患者共病其它精神疾病如抑郁症、药物成瘾、睡眠障碍的比例也高达80%[4]。PTSD主要临床表现为创伤性记忆的反复重现，持续性回避创伤相关线索，认知和心境方面的 消极改变，警觉性增高[5]；多数患者因此丧失劳动和生活能力，给患者本人、家庭、社会均造成极大的负担。临床上常用基于消退原理的暴露疗法（exposure therapy）治疗PTSD[6]，即让病人反复暴露在创伤性情境中，使创伤性记忆逐渐减弱的一类治疗方法。但是，此治疗方法仅对30-70%的PTSD患者产生较好的疗效[7]。因此，有必要研究PTSD中的创伤性记忆消退的机理，以发现新的治疗手段。

条件性恐惧记忆是用于研究PTSD的经典动物模型。在这个模型中，一种原本无伤害的条件刺激（conditioned stimulus，CS，如环境线索或者声音线索）与伤害性的非条件刺激（unconditioned stimulus, US，如足底电击）关联后，CS可以诱导机体产生恐惧反应。条件化恐惧建立后，如果仅CS重复呈现而不呈现US，则CS引起机体条件化恐惧反应的能力将逐渐减弱乃至丧失，该过程称为恐惧记忆的消退[8]。该模型常用于探索恐惧记忆的维持和消退的生物学机制，为病理性的创伤性记忆的消除提供线索。

大量来自动物和人类的研究一致证实，内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex，mPFC）是调控恐惧记忆消退的重要脑区[9,10]。大脑，包括情感和记忆系统，时刻都在整合大量的传入信息并作出合适的输出，这一复杂系统的功能依赖于不同神经环路和网络的动态平衡的维持[11]。神经网络由众多的神经元通过突触连接形成，信息流主要由锥体神经元在脑区间进行传递。局部的抑制性的中间神经元，主要为GABA能神经元，通过调控锥体神经元的发放模式、发放时机、同步化活动和输出，参与信息的整合和处理[12-16]。在条件性恐惧记忆动物模型中，mPFC的抑制性突触可塑性变化参与调控恐惧记忆的长久存储[17]。但是，目前对mPFC调控恐惧记忆的消退的局部神经网络机制尚不清楚。

小清蛋白（PV）阳性神经元是一类重要的GABA能中间神经元[18]。在发育早期，PV神经元主要由低表达PV蛋白的神经元（low-PV神经元）组成；随着发育的进行，low-PV神经元逐渐分化为高表达PV蛋白的神经元（high-PV神经元）[19-21]。最新研究发现，成年动物在学习过程中，在海马由PV神经元构成的局部神经网络表现出明显的可塑性改变。并且，参与调控学习记忆过程，是一种全新的神经可塑性模式[22]。

2021年10月26日，南方医科大学的高天明团队在Molecular Psychiatry杂志上发表了题为“PV Network Plasticity Mediated by Neuregulin1-ErbB4 Signalling Controls Fear Extinction”的研究论文。陈翌华博士和胡能渊博士为共同第一作者。研究工作创新性地发现在mPFC由神经调节素-1（NRG1）-ErbB4信号通路介导的局部PV神经元网络具有长时程可塑性（持续 ＞ 48 h），打破了传统的认为NRG1-ErbB4通路对神经元活动的调节仅具有急性作用 (持续 ＜ 数分钟) 的旧观点，揭示了NRG1-ErbB4通路的新功能；进一步解析了PV神经元网络的可塑性变化通过mPFC长投射神经环路（mPFC-基底内侧杏仁核回路）调控恐惧记忆的消退。该项研究揭示了mPFC介导的“自上而下”调控恐惧记忆消退的局部分子网络机制。（拓展阅读：高天明课题组最新研究，详见“逻辑神经科学”报道：Mol Psychiatry︱高天明课题组揭示星形胶质细胞和神经元在突触可塑性和记忆中的不同作用；JCI︱高天明课题组揭示前额叶皮层在调控焦虑和恐惧中具有相反作用的神经回路）

mPFC 由缘上皮层（prelimbic cortex，PL）和缘下皮层（infralimbic cortex，IL）构成。研究人员发现恐惧记忆的消退可诱导成年小鼠IL脑区PV神经元网络向low-PV增多、high-PV减少模式转变；但不影响PL脑区PV神经元网络的构成。谷氨酸脱羧酶67（GAD67）是GABA合成的关键酶，其表达水平影响GABA的合成水平。研究结果显示，单个PV神经元的PV荧光强度与GAD67的荧光强度呈高度正相关，提示IL脑区PV神经元网络的可塑性改变是一种功能性的改变。进一步研究发现，恐惧记忆消退训练虽不改变PV神经元总的数量，但导致PV神经元网络发生了长程可塑性改变，表现为在消退训练第2到第6天，PV神经元网络向高low-PV、低high-PV转化（图1）。

图1 恐惧记忆消退诱导IL脑区low-PV网络可塑性改变

（图源：Chen et al., Molecular Psychiatry, 2021）

通过化学遗传学方法和药理学方法操纵PV神经元网络可塑性可以调节恐惧记忆的消退进程（图2）。这些结果提示IL脑区PV神经元网络可塑性改变可能是调控恐惧记忆消退的关键神经网络机制。

图2 IL脑区持续的low-PV可塑性改变对恐惧记忆的消退是必须的

（图源：Chen et al., Molecular Psychiatry, 2021）

为了检测恐惧记忆的消退诱导PV神经元网络可塑性改变的分子机制，研究人员检测了8个调节PV神经元分化成熟的分子，结果发现NRG1在恐惧记忆的消退过程中表达水平升高，时间窗上与PV神经网络可塑性的变化相一致；小鼠IL脑区给予外源性的NRG1可诱导PV神经元网络向高low-PV转化，而给予ecto-ErbB4中和内源性的NRG1则具有相反的作用。以往研究表明，NRG1主要是通过ErbB4受体作用于PV神经元[23-25]。因此，研究人员进一步敲除PV神经元上的ErbB4受体，结果显示PV-Cre;ErbB4f/f小鼠high-PV比例显著增加（图3）。这些结果表明NRG1-ErbB4可以调节 IL脑区局部PV神经元网络可塑性。

图3 NRG1-ErbB4信号通路调节PV神经网络可塑性变化

（图源：Chen et al., Molecular Psychiatry, 2021）

研究人员进一步发现中和或敲低IL脑区NRG1， 敲低或敲除PV神经元上的ErbB4受体使恐惧记忆的消退受损；而外源性增加IL NRG1则易化恐惧记忆的消退。这些结果表明IL脑区NRG1-ErbB4可以调节恐惧记忆的消退（图4）。

图4 NRG1-ErbB4信号通路调节恐惧记忆的消退

（图源：Chen et al., Molecular Psychiatry, 2021）

那么NRG1信号是否通过调节PV神经元网络可塑性而调控恐惧记忆的消退呢？研究人员在给予IL脑区外源性NRG1的同时，使用化学遗传学的方法干预局部PV神经元网络可塑性向low-PV 模式转变，发现NRG1对PV神经网络可塑性的调节作用被阻断了，同时对恐惧记忆的消退的易化作用也被阻断了。同理，联合使用ecto-ErbB4 与化学遗传学法，进行反向验证，进一步证实NRG1信号通过调节PV神经元网络可塑性而调控恐惧记忆的消退（图5）。

图5 NRG1信号通过调节PV神经网络可塑性改变调控恐惧记忆的消退

（图源：Chen et al., Molecular Psychiatry, 2021）

文献报导，基底内侧杏仁核（basal medial amygdala，BMA）是mPFC的下游靶脑区，激活投射到BMA的mPFC神经元易化恐惧记忆的消退[26]。因此，研究人员进一步探讨了投射到BMA的IL神经元是否依赖于PV神经元可塑性来调节恐惧记忆的消退。研究人员发现，在恐惧记忆消退后的1.5 h和10 h， 投射到BMA的IL神经元呈激活状态，在时间窗上与消退后PV神经网络可塑性的变化相一致。利用化学遗传学法发现，在恐惧记忆消退后阻止PV神经元网络可塑性的转化，投射到BMA的IL神经元不再被激活，并且恐惧记忆不再进一步消退。这些结果表明mPFC局部PV神经元网络长时程可塑性通过调控长投射神经环路影响恐惧记忆的消退（图6）。

图6 mPFC局部PV神经元网络长时程可塑性通过调控长投射神经环路影响恐惧记忆的消退

（图源：Chen et al., Molecular Psychiatry, 2021）

文章结论与讨论，启发与展望

该项研究的发现与早期报道一致，即IL脑区的可塑性对于恐惧记忆的消退很重要[27,28]。为了阐明IL脑区调节恐惧记忆消退的局部神经网络机制，研究人员采用了两次消退训练间隔24 h的方式，发现消退训练后PV神经网络发生重构，并且这种改变依赖于NRG1-ErbB4信号通路。PV神经网络发生重构在消退后6 h可以观察到，这种变化持续到48 h，这是记忆巩固过程的时间窗，这与记忆巩固可能涉及局部神经网络活动的观点一致[29,30]。

值得注意的是，通过对既往的单细胞测序数据进行分析，发现high-PV神经元的差异表达基因参与离子转运、囊泡介导的转运和GABA能突触传递等功能；而low-PV神经元的差异表达基因参与钙离子跨膜运输和神经系统的发育，表明high-PV神经元是成熟细胞，而low-PV神经元是不成熟的细胞[31,32]。研究人员分析了对照小鼠和消退小鼠的PV神经元中的基因表达，消退组神经元包含更多比例的low-PV神经元，并表现出与low-PV神经元一致的分子特征。由于消退组的神经元仍然是low-PV神经元和high-PV神经元的混合群体，因此消退学习时改变的基因也可能与low-PV神经元可塑性以外的过程有关。这需要进一步开发新技术分离low-PV神经元和high-PV神经元，以证实这个结论。

NRG1的表达受神经元活动的调节[33-35]。恐惧记忆的消退诱导的IL中增强的神经元活动（1.5 h c-Fos峰）可能会刺激NRG1的表达。NRG1在锥体神经元、中间神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中广泛表达[36-38]。同时，NRG1存在不同区域，包括海马和杏仁核[39-41]，这两个脑区是mPFC的输入区域[42,43]。值得注意的是，海马或杏仁核对mPFC的输入对于恐惧相关行为至关重要[44-46]。未来的研究需要探索 PV 网络的可塑性是否取决于IL皮层内的内源性NRG1或其在环路水平上的输入。

先前的工作表明，中和NRG1、抑制或敲除ErbB4受体会减少GABA 能传递[47]。NRG1通过激活ErbB4，增加GABAA受体介导的突触电流[48]并增强去极化诱导的GABA释放[40]。这些结果表明NRG1-ErbB4信号在GABA能活动中起急性增强中起作用。有趣的是，该项研究发现NRG1诱导了持续的low-PV模式，而中和内源性NRG1、敲低NRG1或敲除PV神经元中的ErbB4产生了相反的转变。low-PV神经元代表PV神经元的不成熟状态，并表现出减弱的功能输出。因此，该项研究首次证明NRG1-ErbB4通路的持久作用（至少48小时），可以持续调节局部GABA能活动，揭示NRG1-ErbB4信号在成熟大脑中的新作用.

总之，该项研究发现了以前未知的mPFC介导的自上而下调控恐惧消退的分子和局部神经网络机制。该研究发现IL中局部PV神经元网络的持续可塑性是成年小鼠恐惧消退所必需的，这是由NRG1-ErbB4信号介导的。此外，投射BMA的IL神经元对恐惧消退的调节取决于PV神经元网络的构成，这些研究结果为治疗PTSD等精神疾病提供了新的理论基础。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41380-021-01355-z

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制版︱王思珍

本文完