Nat Commun︱非人类灵长类（猴狨）自闭症模型揭示人类疾病早期发育的生物学异常

撰文︱付慧敏

责编︱王思珍

 标题勘误：“猴狨”更为“狨猴”

自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）是一种具有特征性突触和基因表达变化的多因素神经退行性疾病，患者具有社会互动和沟通受损、重复行为和兴趣受限的特征。报道指出，超过1%的人口诊断出患有ASD，但目前并没有有效的治愈药物【1】。ASD的症状通常在3岁左右变得明显和可诊断，因此在该时间点治疗或早于该时间点治疗是可取的【2】。早期的行为体征可以预测回路发育中已存在的异常，了解ASD早期发育阶段的生物学异常和发病机制对于开发有效的药物治疗具有积极意义。

ASD也被称为一种突触病变，这包括结构水平和分子水平的突触功能障碍。在ASD患者中，皮质神经元的树突棘受到影响【3】。此外，多个ASD相关基因参与突触功能【4】。正常情况下，突触发育以一种精确调控的方式进行：在出生后的早期阶段，过度的突触形成随后是修剪【5】。突触发育涉及2个过程：基因编程的突触发生和活动依赖的重构，这些过程的损害可能会对正常回路产生不利影响，并随后产生ASD症状。

在出生后早期的发育过程中，大脑经历了神经回路组织和基因表达的剧烈变化。突触发生在新生儿期最高，而在儿童时期遵循依赖经历的回路重构【6】。事实上，语言习得和社会学习的敏感时期发生在童年时期【7】。基因表达在新生儿期也会随着突触的发展而迅速变化【8】。突触结构或功能和基因表达的时间相关调控，将把ASD相关的突触表型与分子功能联系起来。

2021年9月，日本国家神经科学研究所、国家神经病学和精神病学中心的Satoshi Watanabe教授（第一作者，通讯作者）和Noritaka Ichinohe（通讯作者）教授等人在Nature Communications上在线联合发表了题为“Functional and molecular characterization of a non-human primate model of autism spectrum disorder shows similarity with the human disease”的研究论文。结果发现，丙戊酸诱导的狨猴模型表现出与人类ASD相似的突触、行为和分子表型。在该模型的产后早期，突触发生减少，而幼年时VPA狨猴的突触发生增加。在婴儿期，丙戊酸诱导的狨猴的突触可塑性短暂增加，并与发声的改变有关，且差异表达的基因与回路重构相关。本研究证明了早期表型在ASD发病机制中的重要性，并为该病早期干预提供了新的分子靶点。

以往研究显示，ASD灵长类模型比啮齿动物模型有优势去研究ASD的发病机制【9】。其中，丙戊酸（VPA）诱导的狨猴后代出现社会行为、轴突束结构和神经免疫细胞的异常，这与人类数据一致【10-12】。而且该课题组之前研究也发现狨猴神经元结构和突触发育与人类的相似性【5】。

在这项研究中，作者们首先阐明了VPA诱导的ASD狨猴模型在突触发生和修剪过程中的突触表型。通过分析VPA诱导（VPA）和未诱导（UE）狨猴的布罗德曼（Brodmann）8b/9区第3层锥体神经元的兴奋性突触结构、微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）和微型抑制性突触后电流（mIPSCs），他们发现VPA诱导的脊柱密度、mEPSC频率和mIPSCs频率的变化从刚出生时（0个月，新生儿）的发育不足过渡到6个月（青春期）的过度发育（图1a-g）。此外，脊柱密度、mEPSCs和mIPSCs的频率的时间介导过程相似（图1h）。VPA诱导在3个月（婴儿期）时会明显下调mESPC频率与mISPC频率的比值，但在0 个月或6个月时没有变化（图1 h, i）。

图1 在VPA诱导的狨猴中，兴奋性突触的早期发育不足和晚期过度发育

（图引自：Watanabe S, et al.,  Nat Comm 2021;12: 5388）

皮质回路中的兴奋-抑制（E/I）平衡是通过突触可塑性进行调节的，E/I平衡异常是ASD的一个主要标志性特征【13】。为了探究上述在3个月时的VPA动物的E/I平衡改变是否是由于兴奋性突触的异常调节导致的，研究者首先低频刺激诱导长时程抑制（LTD），实验发现VPA以年龄依赖性（0-3个月）的方式影响低频刺激诱导的LTD（图2 a, b）。且在3个月时，VPA诱导脊柱体积和突触结构的改变（图2 c, d）。且在3个月时，VPA组狨猴背内侧前额叶皮层的突触后密度（PSD）长度、场EPSP振幅和平均脊柱体积的logFC（log fold change）值均明显降低（图2 e, f）。以上结果表示，产前VPA暴露会影响3个月时的E/I比值、LTD和脊柱体积，而在其它年龄时影响较弱，这表明3个月是另一个具有强突触表型的时间点。

图2  年龄改变VPA诱导狨猴的长时程抑制和脊柱体积

（图引自：Watanabe S, et al.,  Nat Comm 2021;12: 5388）

接下来，课题组假设，早期的突触发育可能会影响早期的社会行为。通过记录和注释孤立环境中约3个月大狨猴的叫声，他们发现VPA组狨猴在孤立过程中的总呼叫数较低，但无显著差异。与UE狨猴相，VPA狨猴产生了更高的“phee”（谐音fèi）声呼叫比例（79%），这导致VPA组动物的呼叫类型熵明显低于UE组（图3）。总之，在婴儿期发现的行为异常可能是出生至婴儿期突触发育异常的结果。

图3 VPA诱导的狨猴中的隔离叫声改变

（图引自：Watanabe S, et al.,  Nat Comm 2021;12: 5388）

考虑到研究过程中存在两种突触表型的时间调控过程，一种在0个月时受影响最大（图1h），另一种在3个月时受影响最大（图1k, 2f），因此课题组推测这些表型伴随着基因表达的改变。通过微阵列寻找VPA调节的差异表达基因（DEGs），并采用k-means聚类方法，将DEGs分为三个聚类来分析基因表达的时间谱（图4）。结果发现，簇1包含与异常突触发育相关的基因，簇2和簇3包含特定发生在3个月时突触调节相关的基因（图4a-f）。并且簇1显著富集了ASD相关（SFARI）基因，簇2富含关键时期相关基因，在关键时期表达最高。通路分析显示，突触发生信号通路是簇1和簇3高度受影响的通路之一，胆固醇生物合成相关通路是簇1和簇2高度受影响的通路之一（图4g）。这些发现表明，不同时间受VPA影响的基因可能参与了ASD突触调节的不同方面。

图4 差异基因表达的微阵列分析

（图引自：Watanabe S, et al.,  Nat Comm 2021;12: 5388）

随后利用上游分析，研究人员们寻找潜在的药物，使0个月和3个月时改变的生物功能正常化。在0个月时，他们预测了他汀类药物和一种抗炎药物；在3个月时，他们预测了各种影响髓磷脂、炎症和钙信号转导的药物（表1）。

表1 上游分析的药物预测在0 M和3 M使基因表达调节正常化

（表引自：Watanabe S, et al.,  Nat Comm 2021;12: 5388）

最后，课题组比较了VPA狨猴与人类ASD的基因表达。结果显示，VPA狨猴在3 和6个月时的基因表达与人类ASD有显著正相关，在0个月时的基因表达与人类ASD没有相关性（图5a）。3个月时狨猴的基因表达与ASD人诱导多能干细胞（iPSC）衍生神经元的基因表达呈负相关，0个月时的狨猴与IPSC来源的神经元之间的基因表达相关性较低（图5b）。VPA狨猴（3或6个月）与死后的人类ASD样本之间的相关性高于出生后35天的大鼠VPA模型与人类样本之间的相关性（图5c）。这些数据表明，VPA狨猴与人类ASD有广泛的相似性。

图5 VPA诱导狨猴与人类ASD的基因表达调节的关系

（图引自：Watanabe S, et al.,  Nat Comm 2021;12: 5388）

图6 文章总结图

（图引自：Watanabe S, et al.,  Nat Comm 2021;12: 5388）

文章结论与讨论，启发与展望本研究发现丙戊酸（VPA）模型狨猴与人类ASD之间的一致性基因模块较多，这表明它比啮齿动物模型更合适作为人类ASD模型。此外，本研究强调了婴儿年龄在ASD发病机制中的重要性，表明早期生物对基因型在ASD中至关重要，回路完全成熟后的表型可能与在青春期之前观察到的表型不同，婴儿和成人ASD患者可能需要不同的治疗方法（图6）。

然而，本研究存在以下局限性。首先，虽然本研究揭示的婴儿期ASD狨猴模型的突触和分子表型与特发性ASD患者的总体情况相似，但如果能确定该模型最能代表的亚型，该模型的有效性将进一步增强。其次，越来越多的证据表明神经胶质细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）参与了ASD的发病机制，而本研究没有讨论星形胶质细胞的作用。第三，本研究提出的早期干预需要早期筛查和诊断，但尚未完全确定。尽管如此，本研究可能有助于未来关于ASD的年龄依赖性治疗的研究。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-021-25487-6

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制版︱王思珍

本文完