脂质与阿尔兹海默症！中枢神经系统中成年后髓鞘的硫苷脂缺少可导致阿尔茨海默病样神经炎症和认知障碍
撰文︱邱淑兰，韩贤林
责编︱王思珍
阿尔茨海默病（AD）是老年人痴呆症的最常见原因， 然而依旧缺乏有效的治疗方法，需要对疾病机制有更多的了解【1】。人类全基因组关联研究指出，除了β-淀粉样蛋白（Aβ）和tau蛋白之外，免疫反应和脂质代谢也是AD病因的主要途径【2,3】。越来越多的证据表明，主要由小胶质细胞和星形胶质细胞介导的慢性神经炎症是AD神经退化中的原因之一【4-6】。同时，大脑是脂质含量和多样性最丰富的器官，主要是由于富含脂质的髓鞘【7】，但脂质与AD疾病的相关性和相关机制研究却非常缺乏。作者和其他人报告了脑硫苷脂（sulfatide）在AD 病人和AD相关动物模型中病症早期就开始的显著下降，并且，此脑硫苷脂下降是由AD最高风险基因ApoE亚型依赖的方式介导的【8-13】。但迄今为止，特定脑脂质的变化是否足以驱动 AD 相关病程仍不清楚。
2021年9月份，来自美国德州大学医学中心圣安东尼奥分校的邱淑兰和韩贤林等作者在Molecular Neurodegeneration上发表了题为“Adult-onset CNS myelin sulfatide deficiency is sufficient to cause Alzheimer’s disease-like neuroinflammation and cognitive impairment”的文章，发现中枢神经系统（CNS）中髓鞘的硫苷脂在成年后的丢失足以激活疾病相关的小胶质细胞和星形胶质细胞，增加了多个AD风险基因以及已确认的AD相关的免疫/小胶质细胞调控的关键调节因子的表达，最终导致AD 样慢性神经炎症和轻度认知障碍。同时神经炎症和轻度认知障碍表现出性别差异，雌性鼠比雄性鼠更明显。随后的机制研究揭示了CNS髓鞘硫苷脂丢失、大脑慢性炎症、星形胶质细胞和小胶质细胞的活化以及AD最高风险基因ApoE之间的关系和胶质细胞活化相关转录因子通路。
脑苷脂磺基转移酶（CST，又名 Gal3st1）催化硫苷脂生物合成的最后一步。脂蛋白基因（Plp1）在CNS髓鞘形成细胞，即少突胶质细胞中大量表达，但在外周神经系统（PNS）的髓鞘形成细胞中的表达程度较低【14】。
在此，为了研究在AD病人和动物模型发病早期硫苷脂下降对脑稳态和认知功能的影响和相关分子机制，作者建立了CST基因Flox小鼠，简称CSTfl/fl小鼠。CSTfl/fl小鼠与Plp1-CreERT小鼠杂交后建立了CST条件敲除（简称CST cKO）小鼠，通过他莫昔芬（tamoxifen，TX）诱导敲除成年小鼠髓鞘形成细胞中的CST基因，从而模拟AD病人早期的硫苷脂下降（图1A）。
作者通过Nanostring高通量mRNA检测方法，脂质组学和蛋白质水平检测确定了此小鼠在3月龄注射TX 4.5个月和9个月后均呈现CNS中CST基因表达（图1B）以及脑苷脂水平（图1C）的显著下调，但在PNS中脑苷脂下降不显著（图1C）。同时作者明确了不同于胚胎期就敲除脑苷脂的CST完全敲除（CST KO）小鼠, 在成年CST cKO小鼠12月龄时的CNS脑苷脂丢失并没有引起其他髓鞘脂质的丢失；同时少突胶质细胞的基因表达（图１D，E）或髓鞘结构蛋白水平（图１F）也没有改变。说明成年后开始的小鼠CNS髓鞘脑苷脂的下调并不破坏髓鞘稳态。同时脑苷脂丢失也未引起CNS中神经细胞或其他细胞的死亡。
图１ 一种新型的可诱导髓鞘形成的胶质细胞特异性条件敲除CST (CST cKO) 的小鼠模型，在不影响少突胶质细胞稳态的情况下模拟了CNS中成年后开始的AD 样髓鞘硫苷脂丢失（CRM：大脑，SC：脊髓，SN：坐骨神经）。
（图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021; 16: 64）
接着，作者对通过神经功能相关行为初筛（图2A）的13月龄的CST cKO小鼠进行了莫里斯水迷宫（Morris water maze，MWM） 和新物体识别（novel object recognition，NOR）实验，结果表明，虽然CST cKO小鼠可能存在与肌肉功能无关（图2B）的游泳时间增加（图2C）、游泳速度下降（图2D）、漂浮时间增加（图2E）等跟认知或运动相关功能障碍，但与运动功能无关的MWM的第六天目标探索（probe）结果（图2F-I）以及NOR结果（图2J）均证明，CNS中成年开始的髓鞘硫苷脂丢失虽然没有引起髓鞘稳态的改变，却足以引起认知功能的损害，以及空间和非空间记忆相关功能的破坏。
图2 成年后开始的硫苷脂丢失足以导致认知损害
（图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021; 16: 64）
进一步地，作者研究了CNS中成年开始的硫苷脂丢失导致认知损害的具体细胞、分子机制。首先利用Nanostring小鼠AD相关试剂盒检测了TX注射后4.5个月和9个月后的大脑和脊髓样本的770个基因，发现CST cKO小鼠的硫苷脂丢失诱发了CNS中的免疫、炎症反应（图3A, B）。接着利用Nanostring小鼠神经炎症相关试剂盒进一步发现：在CST cKO小鼠CNS样本中mRNA水平发生显著上调变化的76个基因富集于小胶质细胞/星形胶质细胞/免疫激活功能。比较CST cKO和CST KO小鼠的Nanostring小鼠神经炎症相关基因表达变化的结果表明：虽然CST KO小鼠中硫苷脂缺失引起了CNS髓鞘损伤，而CST cKO小鼠中成年后硫苷脂丢失并未引起了明显的CNS髓鞘稳态变化（图1D, E），但CNS硫苷脂的缺失都引起了类似的小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，并导致了慢性免疫、炎症反应（图3C-E）。通过基因富集分析发现：髓鞘硫苷脂缺失引起的基因表达变化指向最显著的相关疾病是AD（图4A）。被上调的基因中包括四个AD风险基因Apoe、Trem2、Cd33和Mmp12（图4B-E），以及已被报导的AD关键调节基因Tyrobp、Dock 和Fcerg1（图4F-H）。结合已有的文献报道和作者的结果，进一步明确了硫苷脂缺陷激活的小胶质细胞和星形胶质细胞的基因表达也类似于AD疾病相关的小胶质细胞和星形胶质细胞（图4 I, J）。
图3 CNS 硫苷脂丢失或缺失均诱导渐进的小胶质细胞和星形胶质细胞激活造成的神经慢性免疫、炎症。
（图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021; 16: 64）
图4 CNS 硫脂缺乏导致 AD 样神经炎症，导致疾病相关的小胶质细胞和星形胶质细胞的特征。
（图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021; 16: 64）
然后，作者通过硫苷脂在大脑中的质谱成像（图5A）、硫苷脂缺失引起的激活的星形胶质细胞和小胶质细胞的分布的比较（图5B-E）、激活的星形胶质细胞和髓鞘的共定位（图5F）、以及CST cKO小鼠脊髓中激活的星形胶质细胞与髓鞘的电镜观察（图5H）实验，明确了CST cKO 和CST KO小鼠中硫苷脂和胶质细胞激活存在空间上的关联：硫苷脂缺失引起的胶质细胞激活分布在富含髓鞘的区域。
图5 髓鞘上的硫苷脂缺失导致富含髓鞘的大脑区域内显著的星形胶质细胞和小胶质细胞激活。
（图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021; 16: 64）
ApoE是CNS中主要的细胞外脂质载体，运输多种脂质，包括硫苷脂。同时Apoe4是AD的最高风险基因，并且ApoE4 是降低脑硫苷脂水平所必需的【15】。作者发现ApoE在 CST cKO 和KO的CNS中上调（图4B），从而表明CNS髓鞘上硫苷脂缺失和ApoE上调形成正向反馈。接着作者使用ApoE 和CST双敲除（ApoE-/-/CST-/-）小鼠结合免疫荧光染色（图6A，B）和Nanostring神经炎症试剂盒（图6C-F）发现，ApoE的敲除并不能阻止和影响CST敲除引起的胶质细胞激活和相关的免疫、炎症激活，从而阐明了ApoE 虽然参与硫苷脂转运但并不直接影响髓鞘硫苷脂缺失诱导的胶质细胞激活和神经炎症，ApoE可能通过参与硫苷脂丢失从而引起AD相关慢性神经炎症。
图6 髓鞘硫苷脂缺乏诱导的AD样神经炎症并不直接依赖于ApoE。
（图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021; 16: 64）
已有研究结果表明星形胶质细胞和小胶质细胞的激活相互影响，并且ApoE主要由星形胶质细胞产生。接着作者利用一种集落刺激因子1受体（CSF1R）抑制剂，即PLX3397，消除全脑大部分小胶质细胞从而研究星形胶质细胞、小胶质细胞和ApoE的相互调节关系。有趣的是，虽然PLX3397消除了CST+/+小鼠大脑中的绝大多数以及CST-/- 小鼠大脑中的大部分小胶质细胞，但是免疫染色（图7A, E）和Nanostring神经炎症试剂盒（图7B-D）结果显示，小胶质细胞的消除完全不能影响硫苷脂缺失相关的星形胶质细胞的激活以及ApoE的表达上调。从而证明了硫苷脂缺失相关的星形胶质细胞和小胶质细胞的激活通过独立的途径存在，并且证明了硫苷脂缺失引起的ApoE上调存在于星形胶质细胞中。
图7 CNS硫脂缺失引起的星形胶质细胞增生和ApoE上调不是继发于小胶质细胞活化。
（图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021; 16: 64）
为了再进一步地研究CNS中髓鞘上的硫苷脂缺乏引起的神经炎症的分子机制，作者分析了转录因子评分， 主要目标包括 IRF8、STAT3、SPI1和C/EBPβ（图 8A），已有的研究报道也显示它们参与小胶质细胞或星形胶质细胞的激活【16-19】，同时Spi1 是一个富集于小胶质细胞的AD 风险基因【18】。免疫印迹结果也验证了在CST cKO小鼠大脑和脊髓样本中STAT3和PU.1/Spi1的显著上调、以及其他转录因子C/EBPβ、IRF8的部分上调（图 8B, C）。此外，在PLX3397消除小胶质细胞的样本中，CST敲除鼠的大脑中的STAT3的磷酸化和蛋白水平上调并不受小胶质细胞丢失的影响，说明STAT3也许是星形胶质细胞活化特异的转录调控途径（图8D）。
图8 髓鞘的硫苷脂缺失导致中枢神经系统中SPI1、STAT3 和 C/EBP转录因子的上调。
（图引自：Qiu, S., et al., Mol Neurodegener, 2021; 16: 64）
1）首次建立了在成年后诱导的髓鞘上硫苷脂丢失的小鼠模型，并成功模拟AD病人脑中的硫苷脂下调，而且证明成年后诱导的髓鞘上硫苷脂丢失在检测的时间点并不影响髓鞘稳态；
2）第一次阐明了一种脂质，即CNS髓鞘的硫苷脂，其在成年后的丢失足以激活小胶质细胞和星形胶质细胞，增加了多个AD风险基因以及已确认的AD相关的免疫/小胶质细胞调控的关键调节因子的表达，最终导致AD样慢性神经炎症和轻度认知障碍；
3）阐述了AD风险基因ApoE虽然参与硫苷脂转运，但并不直接影响髓鞘上硫苷脂缺失诱导的胶质细胞激活和神经炎症，ApoE可能通过参与硫苷脂丢失从而引起AD相关慢性神经炎症；
4）证明了硫苷脂缺失相关的星形胶质细胞和小胶质细胞的激活通过独立的途径存在，并且证明硫苷脂缺失引起的ApoE上调存在于星形胶质细胞中；
5）阐明了髓鞘的硫苷脂缺失导致的小胶质细胞和星形胶质细胞激活主要分别由PU1/SPI1、STAT3转录因子调控。
本文的结果强烈表明大脑中的特异性的脂质异常，例如髓鞘上的硫苷脂缺失也许也是AD病理学中神经炎症和轻度认知障碍的重要驱动和促进因素，并且与tau蛋白病无关。但需要后续的研究继续阐明髓鞘的硫苷脂缺失如何分别激活了小胶质细胞和星形胶质细胞。
原文链接：https://molecularneurodegeneration.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13024-021-00488-7
（照片提供自：韩贤林实验室）
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制版︱王思珍
本文完