Dev Cell︱乳酸促进外周神经损伤修复的B面：轴突长时期乳酸代谢增加会导致氧化应激以及轴突退变

撰文︱邓晨柯

责编︱王思珍

神经系统主要由神经元及神经胶质细胞形成神经功能单元。神经胶质细胞（neuroglia）在神经系统中扮演着支持和促进神经元进行冲动传导的角色——一方面它们可以包裹轴突形成绝缘的髓鞘，防止神经冲动相互干扰；另一方面它们也会为邻近的高耗能的神经元提供乳酸/丙酮酸等代谢底物，帮助维持神经元正常的功能【1】。

外周神经系统中的成髓鞘的胶质细胞称为施万细胞（Schwann cell），其在外周神经系统中以两种主要的结构单元出现：在大直径轴突周围，施万细胞将“一对一”地包裹一段神经元轴突，形成一个夹心圆筒结构；而在小直径的轴突周围，施万细胞会“吞没”许多小直径的轴突，形成“一对多”的“Remak Fibers”结构【2】。

乳酸（lactate）是人体的代谢产物之一，由糖酵解生成的丙酮酸（pyruvate）经过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的还原作用生成，而在氧气充足的情况下，乳酸将会在乳酸脱氢酶的逆作用下，重新产生丙酮酸并进入有氧代谢途径代谢，因此乳酸同样也可以作为营养物质为细胞提供能量【3】。

Rheb蛋白是一类小G蛋白，具有GTPase活性，是mTORC1通路中的重要蛋白，调节着细胞的生长，增值和分化。在本文中还介绍到Rheb蛋白可以独立地调节PDH的活性，从而控制着细胞的呼吸代谢【4】。

以往的研究发现：在外周轴突损伤的情况下，施万细胞会改变其代谢方式为神经元提供更多的乳酸，从而支持轴突的生存【5】。由此看来，胶质细胞提供的乳酸似乎对神经元发挥正常功能及抵抗外部应激多多益善，但事实真是如此吗？

2021年10月6日，南方科技大学生命科学学院的肖波教授领导的研究小组在Developmental Cell杂志上发表了文章“Rheb-regulated mitochondrial pyruvate metabolism of Schwann cells linked to axon stability”，对胶质细胞提供的乳酸对维持外周轴突稳定性进行了深入的研究，提出胶质细胞提供的乳酸对于神经元来说可能是一把“双刃剑”——短时期内增加的乳酸可以促进受损轴突的再生，但长时期代谢过量乳酸会导致神经元出现氧化损伤，造成轴突退变【6】。

该研究团队的先前的研究发现，在少突胶质细胞前体细胞（OPCs），中小G蛋白Rheb的基因缺失会导致由mTORC1介导的脑和脊髓神经严重的低髓鞘化。基于这一事实，该团队感兴趣于在外周胶质细胞中Rheb的缺失是否会对其对应的外周神经产生同样的作用。为此，该团队构建了施万细胞特异性Rheb基因敲除（Rheb cKO）的小鼠。透射电镜结果显示，该品系的小鼠坐骨神经的髓鞘厚度有一定降低，并伴随着明显的轴突退化。与此相一致地，对神经轴突的免疫荧光和免疫印迹结果显示，神经损伤标志物SMI32的含量显著上调。这些结果共同显示在Rheb cKO小鼠外周神经出现了病变（图1）。

图1 Rheb cKO小鼠坐骨神经轴突退化和损伤

（图引自：Jia et al. Dev Cell. 2021）

接着，作者联系外周神经轴突的功能，预测退化的神经轴突将会导致小鼠在行为学上的改变。对于Rheb cKO小鼠的步态分析结果提示小鼠的协调能力受损，也同时一定程度上反映了该品系小鼠外周运动神经元的病变。

这样的表型是如何产生的呢？

作者在以往的文章中了解到胶质细胞提供的乳酸可以作为轴突的代谢底物，并在轴突损伤时胶质细胞对轴突提供的乳酸会增加【6】，这很可能增大了线粒体的负荷，而作者在先前的研究中发现轴突神经元因为其高不饱和脂肪酸含量，高耗氧量以及相对较弱的抗氧化防御机制，极易受到氧化损伤。基于这些信息，作者预测，轴突的损伤是由于缺失Rheb蛋白的施万细胞提供了过量的乳酸，导致轴突线粒体处于持续代谢乳酸的高负荷状态，产生了较多的活性氧（ROS），引起了轴突的氧化应激，破坏了轴突中蛋白质和脂质，从而导致了轴突的损伤。

根据这样一个假设，作者首先检测了Rheb cKO小鼠坐骨神经的氧化应激情况，以还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSH）、化物歧化酶1（SOD1）的含量等作为氧化应激的比较指标，结果显示坐骨神经中GSH/GSSH显著降低，SOD1含量和DHE荧光强度显著升高，表明神经细胞正受到较高程度的氧化应激。接着，作者通过对脂质及蛋白过氧化标志物4HNE和DNP的检测，发现Rheb cKO小鼠外周轴突中出现脂质及蛋白的氧化损伤，同时，进一步的透射电镜结果显示轴突中线粒体出现肿胀等损伤，从而有力地证明了Rheb cKO小鼠坐骨神经出现了高水平的氧化应激，并导致了线粒体的损伤和细胞中蛋白质和脂质的氧化损伤（图2）。

图2 Rheb cKO小鼠坐骨神经高水平的氧化应激造成了细胞内蛋白质和脂质的氧化损伤

（图引自：Jia et al. Dev Cell. 2021）

下一步，根据先前做出的假设，作者需要验证是否是缺失Rheb蛋白的施万细胞产生的过量乳酸进入了轴突，进而强迫轴突线粒体进行持续的乳酸代谢，为此作者首先检测了体外培养的施万细胞中的耗氧速率（OCR）和胞外酸化度（ECAR），发现施万细胞OCR明显的降低，而同时ECAR明显的升高。这暗示着施万细胞的呼吸代谢正在进行由有氧呼吸向产乳酸的无氧呼吸转化。根据对Rheb蛋白参与的信号通路的了解，这些改变很大程度上归结于Rheb蛋白调控的PDH活性的降低。对磷酸化的PDH（p-PDH）的免疫印迹实验证实了这一结果，而这种代谢改变很可能导致了轴突的损伤（图3）。

图3 体外培养的Rheb cKO施万细胞的代谢改变导致乳酸生产和释放增多

（图引自：Jia et al. Dev Cell. 2021）

接着，通过使用2DG抑制乳酸的产生，有效的抑制了外周神经的氧化损伤和线粒体的肿胀更加确认了过量的乳酸是诱导氧化损伤及轴突退变的关键（图4）。

图4 2DG处理后Rheb cKO小鼠坐骨神经的氧化损伤降低

（图引自：Jia et al. Dev Cell. 2021）

施万细胞增加的乳酸输出并不能直接确认其流向了外周神经的轴突，为证实这一点，作者从先前的研究了解到在神经轴突和邻近的施万细胞间转运乳酸和丙酮酸等代谢产物的工作由单羧酸转运体（MCT）来完成，则为了确认上述假设，作者利用实时定量反转录PCR（qRT-PCR）和免疫印迹检测了Rheb cKO 小鼠MCT1的mRNA和其蛋白质的水平，发现二者均有明显的上调，表明MCT转运体的显著增加，提高了乳酸转运的通量，因此说明了施万细胞会将产生的大量乳酸转入神经轴突中。

进一步地，作者检测了Rheb cKO小鼠坐骨神经各代谢物含量，发现尽管Rheb敲除的施万细胞线粒体代谢活性降低，但整个坐骨神经组织涉及线粒体代谢的代谢物明显增高，同时乳酸和丙酮酸也明显地增高。又考虑到坐骨神经主要由轴突与施万细胞构成，因此推测Rheb cKO小鼠外周轴突中线粒体正在高负荷地进行着乳酸的代谢。过载的线粒体理论上不可避免的会产生更多的活性氧。为此作者随后通过活性氧指示剂检测Rheb cKO小鼠体内背根神经元（DRG）中活性氧含量，并辅以检测在体外培养的神经元中额外添加乳酸后神经元DRG活性氧含量，两者的明显增加证明了Rheb cKO小鼠外周神经元因代谢过量乳酸产生了更多的ROS（图5）。

图5 Rheb cKO小鼠施万细胞大量输入乳酸导致坐骨神经中线粒体过载并产生了高剂量的ROS

（图引自：Jia et al. Dev Cell. 2021）

作者的后续研究发现，随着小鼠年龄的增长，大量的乳酸输入导致线粒体功能受损，乳酸开始因代谢不完全而堆积，线粒体产生ATP减少，在前期神经细胞还可以通过代偿性地提高糖酵解强度保证能量供应，但到了后期，在老龄小鼠中，随着氧化损伤的增加，产能代谢的损伤无法被增强糖酵解恢复，使得合成的ATP减少，能量的缺失加剧了小鼠外周轴突退变，提示后期轴突线粒体氧化损伤引起的细胞供能不足和自身氧化损伤共同导致了轴突退变（图6）。

图6 老龄的Rheb cKO小鼠神经元的线粒体功能下降，产能代谢紊乱

（图引自：Jia et al. Dev Cell. 2021）

图7 工作总结图

（图引自：Jia et al. Dev Cell. 2021）

文章结论与讨论，启发与展望外周神经系统中的神经元-施万细胞的结构及其相互作用是外周神经维持其正常功能的必要条件。神经元和邻近的胶质细胞的信号传递及代谢耦联在维持神经系统的稳定性中扮演者重要角色，并且胶质细胞的病变是许多神经退行性疾病的罪魁祸首，因此两者之间的相互作用被越来越多的科研工作者关注。

该文的作者发现施万细胞中敲除Rheb会降低PDH活性，导致更多的丙酮酸代谢成为乳酸；而轴突长时期乳酸代谢增加会导致氧化应激以及轴突退变。过去的研究工作提出施万细胞提供的乳酸对外周神经起支持和保护作用【5】，而本研究提出了乳酸对轴突完整性维持的另一面，即长时期过量的乳酸摄入对轴突的毒害作用。同时，在很多疾病状态下如糖尿病和脑衰老中会出现乳酸异常增加【6】，因此本研究可能为阐明衰老和神经退行性疾病的发病机制提供新的研究思路。

当然，该文还存在着一些有待解决的问题，正如文中提出，该文没有对乳酸增加后可能引起的细胞酸化对轴突稳定性的影响进行研究；同时后续的研究还需要验证抗氧化剂是否对乳酸引起的轴突退变有缓解或保护作用。

原文链接：https://www.cell.com/developmental-cell/fulltext/S1534-5807(21)00731-0

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【1】Dale Purves · George, J. A. D. F. W. C. H. A.-S. L. R. D. M. M. L. P. NEUROSCIENCE. 6th Edition. edn,  (Oxford University Press 2017-12-10, 2017).

【2】Harty, B. L. & Monk, K. R. Unwrapping the unappreciated: recent progress in Remak Schwann cell biology. Curr Opin Neurobiol 47, 131-137, doi:10.1016/j.conb.2017.10.003 (2017).

【3】Mathews, C. K. Biochemistry. 4th ed.. edn,  (Toronto : Pearson, c2013, 2013).

【4】Saxton, R. A. & Sabatini, D. M. mTOR Signaling in Growth, Metabolism, and Disease. Cell 168, 960-976, doi:10.1016/j.cell.2017.02.004 (2017).

【5】Babetto, E., Wong, K. M. & Beirowski, B. A glycolytic shift in Schwann cells supports injured axons. Nat Neurosci 23, 1215-1228, doi:10.1038/s41593-020-0689-4 (2020).

【6】Jia, L. et al. Rheb-regulated mitochondrial pyruvate metabolism of Schwann cells linked to axon stability. Dev Cell, doi:10.1016/j.devcel.2021.09.013 (2021).

制版︱王思珍

本文完