Mol Cell︱阿尔兹海默病的新机制：Tau蛋白寡聚化诱导RNA结合蛋白HNRNPA2B1核胞转运并介导m6A-RNA修饰增强

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撰文︱姜路路

责编︱王思珍

微管相关蛋白Tau（MAPT）的错误折叠和聚集是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的核心特征【1】。当神经元发生退行性变时，它们会表现出特征性的病理改变，例如，由错误折叠的Tau蛋白形成的神经原纤维缠结的积累。Tau蛋白的积累与AD患者的认知能力下降密切相关。这些研究进展促使了强大诊断方法以及潜在药物的发展。然而，神经原纤维缠结只是AD病理学的一部分，科学家们一直在努力了解神经原纤维缠结如何导致神经细胞损伤，这对于开发AD的最佳药物和诊断方法很重要。

在健康神经元中，Tau 蛋白与微管蛋白动态结合，发挥稳定微管的作用。疾病状态下，Tau蛋白发生错误折叠，其包含多种形式，包括Tau寡聚化、磷酸化、乙酰化、形成纤维聚集体等【2】。大量文献描述了Tau在疾病时发生的病理改变，但描述Tau在应激和疾病状态下的生物学功能的研究较少。越来越多的证据表明，Tau寡聚体是引起神经元损伤的关键种类，它能诱导RNA结合蛋白聚集结合形成应激小体【3】。应激小体的可逆性结合可以帮助清除错误折叠的蛋白复合物，但当他们慢性持续聚积将导致神经元内广泛的蛋白质合成抑制【4】。目前，寡聚体Tau介导这一反应的分子机制尚不清楚。

2021年8月27日，在以“Interaction of Tau with HNRNPA2B1 and N6-methyladenosine RNA mediates the progression of Tauopathy”为题在线发表于Molecular Cell的最新论文中，美国波士顿大学的姜路路（Lulu Jiang）（ 文章一作）、Benjamin Wolozin（通讯作者）等人研究了这些科学问题。他们报道了在Tau寡聚化过程中，其会捕获RNA结合蛋白HNRNPA2B1和甲基化的RNA转录本，即N6-甲基腺苷（m⁶A）修饰的RNA，形成Tau寡聚体-HNRNPA2B1-m⁶A RNA复合物，调节应激反应、抑制蛋白质合成。在AD模型和病人大脑中，这种复合物持久存在且发生病理变化，从而导致Tau纤维形成、核膜破坏和进行性神经退行性变。

之前的研究也表明 Tau 蛋白聚积可以引起蛋白质从细胞核都细胞浆的转移【5】。Tau会捕获RNA结合蛋白及其转录物，并将它们拖入细胞质【3，4】。这种行为是否应该归咎于 Tau寡聚体呢？为了找到答案，首先，第一作者Lulu Jiang及其同事创建了一种人源野生型Tau，即4R1N Tau的合成型慢病毒表达载体：4R1N Tau与 mCherry（一种易于检测的荧光蛋白）和一种在光照下寡聚化的隐花色素肽Cry2Olig融合，并将慢病毒载体转染原代培养的小鼠神经元以用于表达人源Tau蛋白合成物（图1A）。

然后，科学家们用光遗传学的方法将蓝光照射到细胞上以促进Tau蛋白寡聚化（图1A）。在波长488λ的20µW蓝光灯下20分钟，足以诱导神经元产生稳定的Tau寡聚体，对照组显示，此种低剂量光照本身并不引起细胞改变。60分钟后，Tau开始形成能够由ThioS检测到的神经元纤维缠结。这些Tau蛋白聚积是否会刺激神经元的退行呢？事实上，在光照 60 分钟后，神经树突萎缩并变形；神经元内caspase-3酶活性增强，这是程序性细胞死亡的标志；乳酸脱氢酶LDH也在神经元培养液中检测到，这是神经元退行的先兆。

在Tau寡聚化过程中，神经元发生了哪些分子生物学过程呢？ 作者发现 Tau在T181和 S262位点处被磷酸化（分别由抗体AT270和12E8检测到）。免疫沉淀实验显示，Tau原纤维含有核膜蛋白lamin B2及其受体，暗示细胞膜完整性受到干扰，并且嘌呤霉素（puromycin）方法检测到神经元内蛋白质合成被抑制。为了找出引发这些分子事件的原因，Jiang及其同事利用质谱方法分析了Tau寡聚化过程中蛋白质与蛋白质的相互作用（图1B）。他们将神经元培养物暴露在0、20或60分钟的光照下，然后免疫沉淀mCherry，拉下Tau神经纤维缠结和任何其他与它们结合的蛋白质。结果表明光照20分钟后，Tau蛋白捕获了核包膜蛋白以及参与RNA代谢和RNA剪接的蛋白；光照1小时后，参与细胞死亡的蛋白质也出现在免疫沉淀复合物中。

图1：实验流程（A）；在暴露于光照 20（B左）或 60 分钟（B右）的培养神经元中，Tau 寡聚体捕获蛋白质的质谱分析，HNRNPA2B1大量聚积。

（图引自：Jiang L, et al., Mol Cell. 2021）

通常，HNRNPA2B1位于细胞核中，在那里它结合并稳定RNA，例如N6-甲基腺苷（简称m⁶A）修饰的RNA【6】。 作为最丰富的mRNA修饰，这种甲基化控制着mRNA 的代谢。这引起了Jiang等人的注意。之前也有研究表明m⁶A RNA 在AD小鼠模型APP/PS1小鼠脑中上调【7】。HNRNPA2B1和m⁶A-RNA可能会被Tau纤维捕获在一起吗？科学家们向神经元添加了荧光抗HNRNPA2B1和抗m⁶A抗体，并将它们暴露在光照下60 分钟，发现蛋白质和RNA与细胞质中的Tau原纤维共定位，暗示HNRNPA2B1可能会拖着m⁶A RNA一起运动。为了验证这一点，科学家们通过向培养的神经元中添加小干扰RNA来敲除大约一半的HNRNPA2B1，结果显示，Tau寡聚体的m⁶A RNA少40%。敲低 HNRNPA2B1还减少了caspase-3的酶活性和损伤DNA的数量，暗示这种蛋白质可能在Tau的毒性和神经变性中起作用。

以上分子事件是由人工诱导的Tau低聚物引发的，它们也同样发生在动物模型上吗？事实上，当HNRNPA2B1和lamin B2与来自六个月大小鼠大脑的缠结一起免疫沉淀时，Jiang及其同事在PS19/P301S模型中发现了类似的变化。三、六和九个月大的小鼠在缠结中的m⁶A RNA数量也越来越多。那么，敲低 HNRNPA2B1能保护小鼠吗？科学家们将针对HNRNPA2B1 转录本的shRNA 注射到三个月大小鼠的海马中。两周后，他们注射了从其他P301S小鼠身上提取的Tau低聚物，以促进缠结的传播，三周后，他们检查了脑切片。与P301S对照相比，敲低后海马体中的m⁶A和活性caspase-3更少，Tau寡聚体也更少。由此作者得出结论：HNRNPA2B1有助于Tau毒性，而三联体可能有助于寡聚体的形成。

那么在AD的人类病例中如何呢？在人类缠结中是否存在HNRNPA2B1和m⁶A RNA？研究人员从波士顿大学和埃默里大学的AD中心获得了四名对照者和14名患有AD的人的死后颞叶皮层组织。对于每个病程进展（Braak）阶段，他们都有来自三个人的样本。科学家们用针对 Tau、HNRNPA2B1和m⁶A的抗体标记了组织。在对照中，HNRNPA2B1和m⁶A定位于细胞核，但在AD后期，HNRNPA2B1和m⁶A RNA在细胞质中，它们与Tau共定位（图2）。三者的最强共定位发生在Braak阶段II-IV。m⁶A 在晚期疾病中广泛分布在整个细胞质中，暗示疾病后期它可能以独立于HNRNPA2B1和Tau的方式游离。

图2 AD病人脑中Tau寡聚体（红色）、RNA结合蛋白HNRNPA2B1（紫色）以及m⁶A修饰的RNA（绿色）随着病程进展 （Braak stages）而聚集增强并呈现共定位特征。

（图引自：Jiang L, et al., Mol Cell. 2021）

在Braak后期，甲基化RNA的量似乎也更高。将BraakVI期与I期进行比较，Jiang发现从脑组织中分离的总m⁶A RNA增加了4.5 倍。特别是Tau的共沉淀中，科学家们发现VI阶段的m⁶A是I阶段的6倍。同样，他们发现，尽管病例和对照组具有相似的HNRNPA2B1的总量，然而Braak IV阶段病例的额叶皮层组织中结合HNRNPA2B1的Tau寡聚体是对照组的两倍。作者将差异归因于AD组织在细胞质中比在细胞核中具有更多的Tau寡聚体和更多的HNRNPA2B1。

图3 文章结论图：Tau寡聚化引起RNA结合蛋白及其阅读修饰的RNA发生细胞核质转移，诱导蛋白质合成被抑制和细胞膜完整性受损

（图引自：Jiang L, et al., Mol Cell. 2021）

文章结论与讨论，启发与展望

总结来看，此研究证明提供了以下三点重要信息（图3）：1. 在神经元中，寡聚化过程将甲基化的RNA、RNA结合蛋白拉入细胞质，并形成应激复合物。2. 敲低RNA结合蛋白HNRNPA2B1可以 抑制神经元中蛋白错误折叠。3. 在AD大脑中，随着疾病的恶化，m⁶A甲基化RNA会增多和聚积。

这项工作开辟了一条新途径，研究人员可以用它来探索 AD 的过程，并在此过程中可能开发出治疗该疾病的新方法。同时尚有许多问题等待更多的探索和研究。例如，鉴于甲基化的mRNA 似乎对缠结和毒性很重要，这些转录物究竟是什么，它们有什么作用？目前还不清楚，未来还需要对m⁶A RNA进行测序以找出答案。

另外，除了AD以外，其他蛋白相关疾病呢？是否也有同样的病理改变？HNRNPA2B1或者m⁶A是否可用于疾病的鉴别诊断？这些都是亟待解决的问题。

更重要的，是否可以通过调节RNA的m⁶A修饰发展新的疾病治疗方案呢？期待未来更多的研究予以阐释。

另外，2021年9月3日，该文章被Nature Reviews Molecular Cell Biology引用为研究亮点文章（Research Highlight），题目为“Tau oligomers are linked to m6A-RNA”【8】。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.07.038

姜路路（Lulu Jiang）（左，第一作者），Benjamin Wolozin（右，通讯作者）

（照片提供自：Benjamin Wolozin实验室）

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参考文献（上下滑动查看）  

【1】Scheltens, P., Blennow, K., Breteler, M.M., de Strooper, B., Frisoni, G.B., Salloway, S., and Van der Flier, W.M. (2016). Alzheimer's disease. Lancet 388, 505-517.

【2】Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nat Rev Neurosci 17, 22–35 (2016).https://doi.org/10.1038/nrn.2015.1

【3】Jiang, L., Ash, P.E.A., Maziuk, B.F., Ballance, H.I., Boudeau, S., Abdullatif,A.A., Orlando, M., Petrucelli, L., Ikezu, T., and Wolozin, B. (2019). TIA1 regulates the generation and response to toxic tau oligomers. Acta Neuropathol.137, 259–277.

【4】Wolozin, B., Ivanov, P. Stress granules and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci 20, 649–666 (2019). 

【5】Lester E, Ooi FK, Bakkar N, Ayers J, Woerman AL, Wheeler J, Bowser R, Carlson GA, Prusiner SB, Parker R. Tau aggregates are RNA-protein assemblies that mislocalize multiple nuclear speckle components. Neuron. 2021 May 19;109(10):1675-1691.e9. Epub 2021 Apr 12

【6】Alarco´ n, C.R., Goodarzi, H., Lee, H., Liu, X., Tavazoie, S., and Tavazoie, S.F.(2015). HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell 162, 1299–1308.

【7】Han M, Liu Z, Xu Y, Liu X, Wang D, Li F, Wang Y, Bi J. Abnormality of m6A mRNA Methylation Is Involved in Alzheimer's Disease. Front Neurosci. 2020;14:98. Epub 2020 Feb 28

【8】Baumann, K. Tau oligomers are linked to m⁶A-RNA. Nat Rev Mol Cell Biol (2021). https://doi.org/10.1038/s41580-021-00419-w

制版︱王思珍

本文完