Science︱新发现！发育中腺苷和GABA信号通路共同发挥稳定GABA能突触的功能

撰文︱付慧敏

责编︱王思珍

在发育过程中，大脑回路会经历突触的形成、稳定或消除的阶段，这涉及许多分子机制，特别是γ-氨基丁酸（GABA）介导的突触形成，此过程主要依赖于突触细胞粘附分子，比如神经胶质素和富亮氨酸重复跨膜蛋白，它们与突触前神经红蛋白、Slit样和Trk样家族蛋白质（Slitrks）相互作用[1, 2]。GABA自身可以作为一种神经递质调节GABA能突触的成熟和神经支配模式，此外，GABA还可以通过激活GABA A型受体（GABA_ARs）和上调神经元内钙Ca²⁺水平从而参与突触的成熟、消除和修剪[2, 3]。

腺苷信号通路也参与了发育过程。三磷酸腺苷（ATP）和腺苷可以与GABA在突触上共释放，从而被腺苷A_2A受体（A_2ARs）感知[4]。A_2ARs在控制神经元迁移速度、轴突伸长和树突分支以及神经肌肉连接处的突触稳定或消除中发挥重要的作用[5-7]，但其是否控制着大脑中突触的形成、稳定或消除，尚不清楚。在成人的大脑中，A_2ARs主要在突触前终端表达，并在该处控制突触囊泡释放的概率。然而，在早期大脑发育过程中，神经突触中A_2ARs的数量、位置和功能，也尚不清楚。

2021年11月5日，法国索邦大学的Sabine Lévi教授（通讯作者）和艾克斯-马赛大学的Christophe Bernard（通讯作者）联合在Science上发表了题为“Convergence of adenosine and GABA signaling for synapse stabilization during development”的研究论文，提出了腺苷和GABA信号通路共同调节早期发育过程中小鼠海马GABA能突触稳定或消除的一种新机制。

首先，研究人员发现，在发育中的小鼠海马GABA能突触后，A_2ARs表达瞬时上调，在突触发生过程中，突触A_2ARs的内源性配体ATP和腺苷的释放也上调。在没有突触传递的情况下，A_2ARs或GABA_ARs通过它们各自的配体激活就足以维持GABA能突触。在神经元中敲除A_2ARs或GABA_ARs后，GABA能突触数量都显著减少，使用A_2ARs激动剂CGS21680激活A_2ARs可以挽救缺乏GABA_ARs的神经元中的GABA能突触，但通过GABA_ARs激动剂muscimol激活GABA_ARs则并不能挽救缺乏A_2ARs的神经元中的GABA能突触（图1）。这些结果提示A_2ARs的激活对于GABA能突触稳定似乎是必要和充分的，而只要A_2ARs保持激活，GABA_AR的激活就似乎不必要。也就是说，阻断A_2ARs会导致突触丧失。的确，结果证实，应用A_2ARs拮抗剂SCH58261阻断A_2ARs会引起GABA能突触的丢失及其不稳定。此外，他们还发现A_2ARs在发育早期控制了不同细胞类型和大脑区域的GABA能突触的稳定性，且A_2ARs对GABA能突触的控制仅限于突触发生期间，受到发育的调控；当A_2ARs失活期 ≥20 min时，GABA能突触就会消除，且这种消除不可逆，提示A_2AR介导GABA能突触稳定是时间依赖的。

图1 A_2AR的激活可以稳定GABA能突触（VGAT：囊泡性 GABA转运体）

（图源：Gomez-Castro et al., Science, 2021）

然后，他们研究了导致A_2ARs激活的上游分子机制。ADA和AMPCP消除环境中的腺苷后，海马CA1锥体神经元微抑制性突触后电流的振幅和频率降低了。且腺苷的消除会诱导GABA能突触前和突触后隔室的快速拆卸，导致GABA能突触数量的丢失，而体外通过CGS21680激活A_2ARs可抑制该过程（图2）。在神经胶质细胞中，ADA和AMPCP处理也可诱导突触丢失，而添加CGS21680则会阻止突触丢失。当神经胶质细胞没有足够数量的腺苷来激活A_2ARs时，神经元可以产生腺苷。这表明腺苷激活A_2ARs是维持突触完整性的必要和充分条件。

  图2 突触的稳定需要细胞外腺苷的产生

（图源：Gomez-Castro et al., Science, 2021）

接下来，他们观察了A_2ARs激活的下游效应。A_2ARs可与G蛋白偶联，激活腺苷环化酶（ACs）的活性，从而产生环磷酸腺苷（cAMP）。在海马神经元中，添加IBMX（cAMP磷酸二酯酶的非选择抑制剂）和forskolin（ACs激活剂）可阻止SCH58261（选择性A_2ARs拮抗剂）诱导GABA能突触的丢失，这说明A_2ARs对GABA能突触的控制依赖于ACs-cAMP信号通路的激活。A_2ARs激动剂CGS21680和GABA_ARs激动剂muscimol均可显著提高细胞内cAMP水平，表明GABA_ARs和A_2ARs的激活对cAMP的产生具有加性效应。已知钙调蛋白（CaM）可以激活ACs。因此作者假设，通过调节CaM激活的ACs及其下游效应体，GABA信号传导从而汇聚于A2AR信号通路。作者发现，缓冲细胞内的Ca²⁺会导致抑制性突触的不稳定，这种效应可以通过用CGS21680激活A_2ARs来阻止；在体外培养10天的海马神经元中，敲除GABA_ARs诱导GABA能突触的缺失，而添加CaM激活剂CALP3将抑制该过程，ACs抑制剂SQ22536 处理可阻止CALP3介导的GABA能突触的拯救（图3B）。这表明，CaM通过激活ACs参与了GABA能突触的稳定。总之，在GABA能突触的稳定中，GABA_ARs和A_2ARs通路的汇聚取决于cAMP的产生，且该过程需要Ca²⁺依赖的和CaM激活的ACs的参与。  

图3 钙调素激活的、钙敏感的ACs稳定GABA能突触

（图源：Gomez-Castro et al., Science, 2021）

基于此，进一步地，他们研究了cAMP产生的下游机制。蛋白激酶A（PKA）是A_2ARs激活后cAMP的下游效应因子，PKA介导的桥尾蛋白（gephyrin ）的磷酸化是其突触后稳定和GABA_ARs突触锚定所必需的[8]。因此课题组假设A_2AR-AC-cAMP信号级联激活PKA确保了桥尾蛋白的磷酸化，而该酸化是维持突触中GABA_ARs所必需的。结果显示，用ADA和AMPCP去除环境中的腺苷，用CGS21680激活A_2ARs显著增加了桥尾蛋白Ser303位点的磷酸化，且该位点的磷酸化是A_2AR介导突触稳定所必需的（图4A, B）。作者用PKA磷酸化位点S303D和S303A 突变体以分别模拟桥尾蛋白的磷酸化和去磷酸化状态，发现过表达PKA S303D突变体可挽救敲除GABA_ARs的神经元的GABA能突触丢失（图4C），表明通过CaM-AC-cAMP-PKA信号通路介导的桥尾蛋白Ser303位点的磷酸化，A2ARs的激活调控GABA能突触的稳定。且磷酸化的桥尾蛋白可以与突触后的突触形成分子Slitrk3 相互作用，参与A_2AR和GABA_AR依赖的突触稳定，表明A_2AR信号通路通过PKA依赖的桥尾蛋白磷酸化和Slitrk3招募来稳定GABA能突触。

图4 GABA能突触的稳定需要卟啉ser303位置的磷酸化

（图源：Gomez-Castro et al., Science, 2021）

最后，在动物实验中，他们发现敲除或阻断A_2AR会导致小鼠海马体P16处GABA能突触的丢失。在突触发生过程中，体内干扰A_2AR会对小鼠认知功能造成长期的有害影响。

图5 文章总结图：腺苷信号转导稳定新生的GABA能突触  

（图源：Gomez-Castro et al., Science, 2021）

文章结论与讨论，启发与展望该研究所描述的A_2AR机制有助于理解突触在发育过程中是如何稳定或移除的。在神经发育过程中，不活跃的突触被消除，这就需要一个来自突触前终端的活动检测器以及一种在检测器未被激活时去除突触的机制。除了GABA本身的参与外，腺苷激活的A_2AR可以参与这些功能。

腺苷和ATP在发育过程中与GABA共释放，这将直接为A_2ARs提供突触前终端活跃的信息。一旦被激活，G蛋白偶联的A_2ARs将触发细胞内cAMP水平的升高，进而导致PKA的激活和GABA能突触的稳定。当A_2ARs不激活时，PKA诱导的桥尾蛋白的持续磷酸化被阻止，进而调节某些GABA能突触的消除。咖啡因一种世界上最常见的精神药物，以往研究显示，其作为A_2ARs的天然拮抗剂，在突触发生前后期可以触发一些突触的抑制，并产生有害的影响。

原文链接：：https://doi.org/10.1126/science.abk2055

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参考文献（上下滑动查看）  

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2. Z. J. Huang, P. Scheiffele, GABA and neuroligin signaling: Linking synaptic activity and adhesion in inhibitory synapse development. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 77–83 (2008). doi: 10.1016/j.conb.2008.05.008; pmid: 18513949

3. T. S. Perrot-Sinal, A. P. Auger, M. M. McCarthy, Excitatory actions of GABA in developing brain are mediated by l-type Ca2+ channels and dependent on age, sex, and brain region. Neuroscience 116, 995–1003 (2003). doi: 10.1016/S0306-4522 (02)00794-7; pmid: 12617940

4. Y. H. Jo, L. W. Role, Coordinate release of ATP and GABA at in vitro synapses of lateral hypothalamic neurons. J. Neurosci. 22, 4794–4804 (2002). doi: 10.1523/JNEUROSCI.22-12-04794.2002; pmid: 12077176

5. C. G. Silva et al., Adenosine receptor antagonists including caffeine alter fetal brain development in mice. Sci. Transl. Med. 5, 197ra104 (2013). doi: 10.1126/scitranslmed.3006258; pmid: 23926202

6. S. Alçada-Morais et al., Adenosine A2A receptors contribute to the radial migration of cortical projection neurons through the regulation of neuronal polarization and axon formation. Cereb. Cortex, 10.1093/cercor/bhab188 (2021). doi: 10.1093/ cercor/bhab188; pmid: 34184030

7. L. Nadal et al., Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol. Brain 9, 67 (2016). doi: 10.1186/s13041-016-0248-9; pmid: 27339059

8. P. Zacchi, R. Antonelli, E. Cherubini, Gephyrin phosphorylation in the functional organization and plasticity of GABAergic synapses. Front. Cell. Neurosci. 8, 103 (2014). doi: 10.3389/ fncel.2014.00103; pmid: 24782709

制版︱王思珍

本文完