Neuron︱调节成人中枢神经系统损伤的轴突再生的新通路

撰文︱付慧敏

责编︱王思珍

哺乳动物的中枢神经系统（CNS）神经元在胚胎或出生后早期的发育过程中失去了轴突再生的能力，因而限制了成年损伤后的恢复[1,2]。成年哺乳动物CNS中的轴突在脊髓损伤后不能再生。神经元的外部和内在过程可导致CNS这种再生能力的发育下降[3]，最近研究发现了导致再生失败的神经元和外部CNS过程的细胞和分子变化，但神经元生长能力丧失背后的潜在机制，仍不清楚。

与大多数中枢神经元不同，当外周神经损伤（PNL）后，成年受损脊髓中的背根神经节（DRG）神经元能够重建其中枢轴突生长能力[4]。这一过程依赖于再生基因表达程序的诱发，包括再生相关基因的上调（如ATF3、c-Jun、Stat3）、以及生长限制基因的下调（如编码电压门控钙离子通道辅助亚基的基因Cacna2d2）。尽管目前鉴定了各种调节轴突生长能力的基因，但具体的分子过程并未阐明。

近日，德国神经退行性疾病中心的Frank Bradke教授课题组在Neuron上发表了题为“An active vesicle priming machinery suppresses axon regeneration upon adult CNS injury”的文章，发现了成年初级感觉神经元在获得轴突快速生长的能力时，下调了突触的关键成分。药物遗传学降低神经元兴奋性则会刺激轴突再生。突触前活性区的关键成分Munc13和RIM抑制成年小鼠的轴突生长。给药巴氯芬可减少初级感觉神经元中电压依赖性的Ca²⁺内流，并促进脊髓损伤后的轴突再生。这些发现表明功能性的突触前活动区构成了轴突再生的主要障碍。

首先，为了探索驱动轴突生长和再生的分子机制，作者在DRG神经元中寻找与轴突生长能力相关的基因表达特征。他们发现DRG神经元可能产生轴突生长相关基因表达特征。进一步验证后发现，培养的DRG神经元与条件PNL诱导神经元之间存在一个正相关的基因表达特征，且当轴突达到最高的生长速度时，相关性随着培养时间的推移而增强。且他们发现发育性轴突生长所需的基因从发育早期开始就保持上调，当轴突到达其靶细胞时，抑制轴突生长的基因表达程序可能会抑制生长。在条件PNL诱导神经元和成年培养的DRG神经元中，小鼠胎龄12.5天和17.5天之间上调的基因呈现下调的趋势，且随着轴突加速生长，这种负相关随着培养时间的推移而逐渐增强，这说明成年DRG神经元可能具有一种与轴突生长能力的生长抑制基因的表达特征。转录组分析显示，与6小时相比，338个与“突触”相关的基因在DRG神经元体外培养36小时后表达下调，且这些基因的整体表达与轴突生长能力呈负相关。下调的基因在（通路）突触囊泡对接、诱发和Ca²⁺依赖的突触囊泡融合激活中富集，突触囊泡膜和突触囊泡外组分相关基因也有富集。这些数据表明，DRG神经元建立了一个与轴突生长能力呈负相关的基因表达特征，即对突触传递至关重要的编码蛋白质的基因可能参与了轴突的抑制再生（图1）。

图1 DRG神经元在获得轴突生长能力时下调核心突触传递基因

（图源：Hilton et al, Neuron 2021）

鉴于DRG神经元在获得轴突生长能力时，下调了对Ca²⁺依赖的突触囊泡融合激活至关重要的基因，因此作者假设降低神经元的兴奋性将促进轴突再生。研究人员通过hM4Di（一种通过化学遗传技术改造的特定药物激活的受体）激活处理降低DRG神经元的兴奋性，并发现hM4Di的激活刺激了脊髓损伤后的轴突再生。hM4Di激活处理促使的大多数再生在脊髓损伤后3天内迅速发生，条件性PNL损伤后也出现类似的快速再生反应。这表明降低损伤背柱轴突的兴奋性会刺激脊髓损伤后的轴突再生（图2）。

图2 神经元兴奋性的药物遗传学降低刺激轴突再生

（图源：Hilton et al, Neuron 2021）

然后，研究人员分析了递质释放机制的不同成分，发现这些成分在具有轴突生长能力的神经元中被下调，包括囊泡相关膜蛋白（VAMP）家族成员VAMP1和VAMP2，然而轴突的生长和再生不依赖于VAMP成员VAMP1-3。此外，与6小时相比，表达活性区蛋白Rab3相互作用分子1（RIM1）和RIM2在DRG神经元细胞培养36小时后的表达下调，RIM1/2基因敲除可增强DRG神经元的轴突生长并减少轴突分支，证明了RIM1/2缺失促进轴突生长。

考虑到突触前核心活性区蛋白Munc13不仅是RIM调节囊泡对接、诱发的效应物，而且是突触囊泡对接、诱发和融合所必需的蛋白[5,6]，课题组对其在轴突生长和再生中的作用进行了探究。结果发现，Munc13-1在细胞生长时间延长的成年DRG神经元中和细胞培养24小时的DRG神经元中的表达下调，而Munc13-1过表达可限制DRG轴突的生长、促进DRG轴突的分支，这说明Munc13蛋白水平的增加可以将具有生长能力的神经元转化为没有生长能力。进一步研究显示，Munc13敲除会增强体外的轴突伸长、减少分支；在Munc13敲除的神经元中，成年小鼠脊髓损伤后的轴突再生的能力会增强。这些数据表明Munc13的表达可抑制轴突生长和再生（图3 A, B）。

图3 Munc13缺失促进了成人中枢神经系统损伤后的轴突再生

（图源：Hilton et al, Neuron 2021）

先前的研究表明，Ca²⁺信号通路可抑制DRG神经元的轴突生长和再生[7]，而Munc13s可以通过调节电压门控钙离子通道（VGCCs）来影响Ca²⁺信号通路[8]。因此，研究人员探索了VGCC激活和Munc13在抑制轴突生长中的关系。在对照组神经元中，VGCC去极化或（VGCC激动剂）激活处理抑制了神经元的轴突生长，并增加了分支结构。但在Munc13敲除神经元中，VGCC去极化或激活处理并不影响神经元持续的生长增加和分支减少的趋势，表明通过VGCC激活或去极化抑制轴突生长需要Munc13的参与（图3 C-H）。

图4 巴氯芬可促进脊髓损伤后的轴突再生

（图源：Hilton et al, Neuron 2021）

随后，作者推断减少触前Ca²⁺内流可以通过减弱Munc13介导的轴突生长抑制来促进轴突再生。在成年DRG神经元中，他们发现突触传递药物巴氯芬（baclofen）处理可将电压门控Ca²⁺电流的振幅降低到基线值的79.3% ±11.3%。在一定浓度范围内，巴氯芬增强了对照组神经元中DRG轴突的生长、并减少了分支，但它对Munc13敲除神经元中DRG轴突的生长或分支没有明显影响。这表明巴氯芬促进轴突生长需要Munc13蛋白的存在。体内实验也证明了巴氯芬能促进脊髓损伤后的轴突再生，该课题组前期研究发现普瑞巴林（pregabalin，PGB）阻断VGCCs辅助亚基可促进脊髓损伤后的轴突再生[7]，于是他们比较了PGB与巴氯芬在促进损伤后再生方面的效应。相对于对照组小鼠，PGB和巴氯芬都刺激了脊髓损伤小鼠的感觉轴突再生。在损伤位点和距离损伤位点近距离处，PGB和巴氯芬诱导的轴突再生程度无差异。然而，在距离损伤位点较远距离处（400-600 µm和600-800 µm），巴氯芬比PGB刺激更多的轴突再生。总之，全身给药巴氯芬可刺激成人脊髓损伤后的感觉轴突再生（图4）。

图5 文章模式图：一种活性囊泡启动机制抑制成年中枢神经系统损伤后的轴突再生  

（图源：Hilton et al, Neuron 2021）

文章结论与讨论，启发与展望

该研究发现了突触前活性区的核心成分在抑制成年期神经元再生能力方面的关键作用。神经元有效生长轴突的能力需要一个“去成熟”和突触功能丧失的过程。具有生长能力的成年神经元可能已经包含了驱动轴突生长和再生所必需的基因集，成年神经元的成熟程序启动后，一旦突触连接建立，成熟程序就会抑制轴突进一步的生长。该研究工作支持了一个模型，在这个模型中，神经元广泛成熟，更具体地靶向神经支配，通过表达一组基因，从而阻止轴突生长，限制轴突再生。事实上，这种基因表达特征涉及突触前活性区的关键成分。本研究表明，Rab3相互作用分子1（RIM）和突触前核心活性区蛋白Munc13可通过囊泡对接、诱发和融合的功能而不是通过影响Ca²⁺信号来限制轴突生长。

神经元活动在损伤后轴突生长中的作用是复杂的。Ca²⁺通道可抑制轴突再生，与突触前活性区Ca²⁺内流的变化相比，Ca²⁺信号通路的整体变化可能在神经元中具有不同的信号通路效应。鉴于DRG神经元在获得轴突生长能力时下调活性区分子表达，未来的研究将研究其它再生促进策略如何改变突触前活动区的功能。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2021.10.007

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参考文献（上下滑动查看）  

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制版︱王思珍

本文完