Nat Biotechnol | 李毓龙实验室开发新型荧光探针用于检测内源大麻素的时空动态变化

撰文︱董  傲

责编︱王思珍

人类历史上，大麻已被驯化并使用了数千年。完成于汉代的中国最古老的药书《神农本草经》中记载：“麻蕡（即大麻果实），味辛平。主五劳七伤，利五脏，下血，寒气。多食，令人见鬼，狂走。久服，通神明，轻身”，这不仅介绍了大麻的药学功效，还描述了人摄入大麻所引发的幻觉等精神活动的变化。现在人们已经知道，古书上所记载的大麻对人精神活动的影响是由其天然成分大麻素类分子进入人体后作用在内源大麻素系统而实现的。

图1 大麻形态示意

（图源：Ellinor Lar）

内源大麻素（endocannabinoids，eCBs），包括花生四烯酸甘油酯（2-Arachidonoylgylcerol，2-AG）和花生四烯酸乙醇胺（N-arachidonoylethanolamide，AEA），是由神经元合成和释放的一类脂类神经调质分子。经典神经递质从突触前末梢释放，激活突触后膜受体；而eCB“反其道而行之”——在突触后神经元释放，逆行性地作用在特定类型神经元突触前膜大麻素受体CB1R（Cannabinoid receptor type 1）上，发挥突触前抑制作用。近二十年来的研究发现，eCB参与大脑多个脑区，包括皮层、海马、纹状体、杏仁核、下丘脑和黑质等，的突触可塑性调节，对维持神经系统的正常功能至关重要，与奖赏行为、能量代谢、学习记忆、睡眠觉醒、情绪等多种生理过程密切相关[1, 2]。内源大麻素系统的调控异常也与神经退行性疾病、癫痫、成瘾、抑郁症和精神分裂症等诸多神经疾病和精神类疾病密切相关[3-7]。然而，目前缺乏高灵敏度、高时空分辨率的实验手段直接检测在体eCB的动态变化，极大地限制了人们对其在生理和病理状态下重要功能和分子调控机理的研究。

2021年11月11日，北京大学的李毓龙实验室在Nature Biotechnology在线发表了题为“A fluorescent sensor for spatiotemporally resolved imaging of endocannabinoid dynamics in vivo”的研究论文，报道了新型基因编码的内源大麻素探针GRAB_eCB2.0的开发和在体内外多种场景下的应用。李毓龙实验室自2018年以来，先后开发了针对乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、腺苷、五羟色胺等神经递质/调质的荧光探针，此次发表的GRAB_eCB2.0是其又一力作，进一步扩展了GRAB系列荧光探针家族。

在这一工作中，李毓龙实验室运用其先前设计的GRAB探针策略（GPCR activation-based sensor），基于人源大麻素受体CB1R和循环重排的绿色荧光蛋白cpEGFP开发了eCB探针eCB2.0。在体外培养的HEK293T细胞和原代神经元中，eCB2.0探针均表现出良好的细胞膜定位，对外源加入的大麻素AEA和2-AG有亚微摩至微摩级的亲和度，秒级的动力学响应和高度的分子特异性（图2）。此外，eCB2.0探针不会激活GPCR下游信号通路。表明探针本身对细胞的正常生理活动没有明显影响。

图2 eCB2.0在HEK293T细胞和原代神经元上的表现

（图源：Dong A et al., Nat Biotechnol, 2021）

那么，eCB2.0能否用来检测神经元释放的eCB ？作者先从体外培养的原代神经元入手，证明eCB2.0能够检测到电刺激引发的来自神经元的eCB释放。通过药理学方法，作者发现此时神经元释放的eCB类型主要为2-AG。此外，作者还发现，即使不给予电刺激，也能记录到离散分布的直径约为10微米的自发性eCB2.0信号，表明eCB的释放具有特异和局部的特性。在急性脑片这一更接近生理条件的体系中，电刺激和高钾溶液刺激均能引起eCB的释放，其局部释放的特点也再次被验证：eCB2.0能够以单个轴突扣结（bouton），即单个突触的空间分辨率，检测到海马体CB1R阳性神经元上的eCB信号（图3）。

图3 急性海马体脑片上由高钾溶液刺激引发及自发的内源大麻素信号具有单个突触的分辨率

（图源：Dong A et al., Nat Biotechnol, 2021）

基底外侧杏仁核（basolateral amygdala，BLA）是介导恐惧反应和加工厌恶记忆的关键脑区[8]。内源大麻素受体CB1R在此处有高水平的表达[9]。为了研究活体动物在受到伤害刺激时BLA脑区处的eCB动态变化，作者借助AAV病毒在小鼠BLA表达eCB2.0探针并使用光纤记录的手段成功检测到给予小鼠足部电击时的BLA脑区中eCB的信号。另一方面，在海马体CA1脑区，作者使用活体双光子双色显微成像的方式，记录了小鼠跑步时CA1区神经元的钙信号和eCB信号，发现跑步行为总是伴随着CA1神经元的兴奋以及eCB信号的上升。表明eCB2.0探针能够实时检测小鼠在生理条件下（运动过程中）大脑中内源大麻素的动态变化（图4）。

图4 小鼠受到足部电击时BLA脑区的内源大麻素信号和小鼠跑步时海马体CA1脑区的内源大麻素信号

（图源：Dong A et al., Nat Biotechnol, 2021）

当大脑处于疾病状态时，eCB的释放又会呈现什么样的变化呢？过去的研究发现，内源大麻素系统受损的动物易发癫痫[10]。为了探究癫痫和eCB信号的联系，作者构建了癫痫模型小鼠，并借助双光子成像记录了小鼠癫痫发作时的神经元活动和eCB动态。有意思的是，当小鼠被诱导发生癫痫时，海马体CA1区神经元表现出剧烈的钙信号活动并伴随强烈的eCB信号上升；更有意思的是，紧随着癫痫发作后，作者在CA1脑区记录到了沿着水平方向传递的强烈的“钙波”信号和“eCB波”信号（见视频1）。

视频1 小鼠癫痫发作前后的海马体CA1脑区的内源大麻素信号和钙信号的变化，注意内源大麻素波和钙波的传递

（图源：Dong A et al., Nat Biotechnol, 2021）

文章结论与讨论，启发与展望

总而言之，在这项工作中，作者开发了世界上第一个内源大麻素探针，首次在体外和体内情况下实现了对内源大麻素的高时空间分辨率记录。eCB2.0探针还存在一些不足，例如动力学响应速度相比其他的神经递质探针较慢、对两种内源大麻素2-AG和AEA还无法区分、对2-AG的亲和力相对较低等，有待在后续开发过程中进一步优化。eCB探针的出现将会促进长期以来一系列关于内源大麻素系统的基本问题被解答，例如释放内源大麻素的细胞类型、内源大麻素释放的机制、扩散距离、作用时间、靶向亚细胞结构等，并为深入研究内源大麻素在病理条件下的作用提供帮助。

值得一提的是，这项研究的合作者美国斯坦福大学Ivan Soltesz实验室借助eCB2.0探针就内源大麻素在大脑中的动态及其在癫痫中的作用进行了更进一步的研究，相关成果同期发表在Neuron杂志上[11]。

Ivan Soltesz实验室借助eCB2.0探针解析了活体动物海马体内源大麻素信号的分子特性和时空动态。他们发现，相较于正常生理活动时，癫痫引起大量2-AG的释放，而2-AG为长时程的中风样症状提供了基础底物[11]。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-021-01074-4

李毓龙，通讯作者

（照片提供自李毓龙实验室）

北京大学生命科学联合中心2021届博士毕业生董傲为本文第一作者，北京大学生命科学学院的李毓龙教授为通讯作者。清华大学本科毕业生何凯凯、北京大学博士研究生蔡儒仪、王欢、本科毕业生段佳丽等对文章做出了重要贡献。该工作得到了美国国立卫生研究院David Lovinger实验室、美国冷泉港实验室Bo Li实验室、美国斯坦福大学Jun Ding实验室和Ivan Soltesz实验室等团队的合作，并得到北京大学膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、国家自然科学基金、北京市科委及美国NIH脑计划等机构和经费的大力支持。

实验室介绍

李毓龙

北京大学麦戈文脑科学研究所PI

北京大学生命科学学院教授

北大-清华生命科学联合中心PI

研究领域：

人的大脑由数十亿的神经元组成，后者又通过数万亿的突触组成复杂的神经网络。不同种类的神经元经过或远或近的投射，通过突触与其他神经元进行信息交流，实现感知觉、决策和运动等高级神经功能。

研究大脑的最大挑战在于脑的高度复杂性。我们实验室集中在神经元通讯的基本结构突触上，从两个层面上开展研究：一是开发前沿的工具，即开发新型成像探针，用于在时间和空间尺度上解析神经系统的复杂功能；二是借助先进的工具探究突触传递的调节机制，特别是在生理及病理条件下对神经递质释放的调节。

具体而言，对于工具开发，我们集中于：

1、结合光遗传学和荧光成像，无损伤性的研究神经元之间的电突触连接。电突触的异常可导致耳聋、癫痫、脑部肿瘤和心脏功能异常等疾病。2、开发可遗传编码的检测神经递质/调质的荧光探针。神经递质/调质是神经元化学突触传递的关键介导分子，与感知、学习和记忆以及情绪密切相关。　利用上述荧光探针，我们的功能性和生理性的研究集中于：1、结合生物信息学、分析化学、生物化学、生理学和成像学方法，系统地探索和鉴定潜在的新型小分子神经递质。2、研究神经元中重要的分泌性囊泡“高密度核心囊泡”的蛋白质组学，分析囊泡内的神经肽组成。这些神经肽对于调节食物摄取、侵犯性行为和生物节律有重要的调节作用。3、寻找上述新型化学递质/调质小分子的对应受体，即寻找“孤儿”受体的配体。4、结合双光子成像和可遗传编码的荧光探针，使用果蝇和小鼠作为模式生物，研究嗅觉传导或睡眠过程中脑的工作机制。更多李毓龙实验室工作详见：http://yulonglilab.org/往期文章精选 优质科研培训课程推荐

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参考文献（上下滑动查看）  

1, Kano, M., Ohno-Shosaku, T., Hashimotodani, Y., Uchigashima, M. & Watanabe, M. Endocannabinoid-mediated control of synaptic transmission. Physiol. Rev. 89, 309–380 (2009).

2, Chevaleyre, V., Takahashi, K. A. & Castillo, P. E. Endocannabinoid-mediated synaptic plasticity in the CNS. Annu. Rev. Neurosci. 29, 37–76 (2006).

3, Oddi, S., Scipioni, L. & Maccarrone, M. Endocannabinoid system and adult neurogenesis: a focused review. Curr. Opin. Pharmacol. 50, 25–32 (2020).

4, Moreira, F. A. & Lutz, B. Te endocannabinoid system: emotion, learning and addiction. Addict. Biol. 13, 196–212 (2008).

5, Guindon, J. & Hohmann, A. G. Te endocannabinoid system and pain. CNS Neurol. Disord. Drug Targets 8, 403–421 (2009).

6, Kesner, A. J. & Lovinger, D. M. Cannabinoids, endocannabinoids and sleep. Front. Mol. Neurosci. 13, 125 (2020).

7, Silvestri, C. & Di Marzo, V. Te endocannabinoid system in energy homeostasis and the etiopathology of metabolic disorders. Cell Metab. 17, 475–490 (2013).

8, Li, B. Central amygdala cells for learning and expressing aversive emotional memories. Curr. Opin. Behav. Sci. 26, 40–45 (2019).

9, Katona, I. et al. Distribution of CB1 cannabinoid receptors in the amygdala and their role in the control of GABAergic transmission. J. Neurosci. 21, 9506–9518 (2001).

10, Soltesz, I. et al. Weeding out bad waves: towards selective cannabinoid circuit control in epilepsy. Nat. Rev. Neurosci. 16, 264–277 (2015).

11, Farrell, J. S. et al. In vivo endocannabinoid dynamics at the timescale of physiological and pathological neural activity. Neuron 109(15), 2398-2403 (2021).

制版︱王思珍

本文完