Cell Rep︱首次！轴突导向分子Robo2影响海马回路功能的新机制
撰文︱付慧敏
责编︱王思珍
适当的回路功能依赖于具有高度细胞和亚细胞特异性的突触连接的建立，然而目前这种突触特异性在发育过程中是如何实现的还不清楚，特别是在哺乳动物复杂的大脑中。研究已经发现，许多特异性的细胞表面分子，如跨突触粘附分子，能够调节特定神经元细胞类型的轴突和树突之间的分子识别[1-3]。这些分子通过直接或间接地招募关键的突触前、突触后蛋白，从而具有突触组织特性。当轴突到达其目标区域时，细胞必须从生长和分支阶段转换到突触发生阶段，期间伴随特征性的粘附动态不稳定性，逐步导致更加稳定的成人回路突触连接模式。突触的形成是如何与早期发育步骤在机制上相整合呢，比如轴突导向和分支？研究显示，一些轴突导向（axon guidance）分子，如EphB、Netrin-1/DCC、Semaphorins，在突触形成和突触可塑性等发育过程中发挥功能[4-6]。但很少有研究关注这些突触发生因子在体内神经回路功能中突触特异性建立方面的异常和作用。
近期，美国哥伦比亚大学的Franck Polleux课题组和Attila Losonczy课题组等联合在Cell Reports上发表了题为“Synaptogenic activity of the axon guidance molecule Robo2 underlies hippocampal circuit function”的文章。研究者发现轴突导向分子Robo2对于建立体内海马CA1椎体神经元的突触连接至关重要，Robo2的细胞自主缺失以一种输入特异性的方式影响CA1椎体神经元中兴奋性突触的形成，并对位置细胞特性的出现产生重大影响。该研究为了解哺乳动物大脑发育过程中突触特异性和回路特性出现之间的分子机制提供了见解。
为了确定轴突导向配体-受体对，即Slit/Robo，是否可能参与轴突导向完成后的神经元发育阶段，首先他们确定了其在出生后小鼠海马中的区域特异性和亚细胞定位。结果发现Robo2 mRNA在P14海马所有区域表达，Robo1和Robo配体Slit2在海马体内的表达主要局限于CA3区域。在CA1中P35处，Robo2蛋白在CA1区始层（ stratum oriens，SO）和辐射层（ stratum radiatum，SR）中特异性表达。实时成像显示，Robo2-全氟蛋白与兴奋性突触后支架蛋白Homer1c共同定位于皮质锥体神经元的树突状棘中。免疫印迹（western blotting）分析发现内源的Robo2和Slit2同时定位于突触前膜和突触后膜，但Robo2富集于突触后膜，其配体Slit2富集于突触前膜。这些结果表明Robo2在发育中和成熟的海马体中表达，并定位于兴奋性突触（图1）。
图1 Robo2在海马体中的表达模式及其在突触上的亚细胞定位
（图源：Blockus, H. et al., Cell Reports, 2021）
接下来，通过使用子宫内靶向海马电穿孔的方法在小鼠CA1椎体神经元（pyramidal neurons，PNs）中细胞自主删除Robo2。他们发现在整个发育过程中，CA1 PNs中删除Robo2导致近端树突部分的脊柱密度显著降低，兴奋性突触后电位的频率显著降低，而其余事件的振幅没有显著差异。在CA1 PNs中，Robo2是突触后以输入特定的方式形成40%的兴奋性突触所必需的（CA2/CA3输入所需要）。这些结果证明CA1 PNs的突触后兴奋性突触形成需要Robo2。其次，在HEK293细胞中，Robo1或Robo2的表达都导致了轴突Vglut1在细胞周边周围的强烈聚集，但Robo2的表达并没有诱导来自周围轴突的突触前抑制性Vgat1（囊泡性GABA转运体1）的聚集。这些数据显示Robo1和Robo2以Slit依赖的方式特异性地诱导兴奋性突触的形成，而不是抑制性突触。
随后，作者假设Robo及其分泌的配体Slit的突触生成功能依赖于与一个未知的突触前跨膜蛋白的相互作用。质谱分析发现Neurexin1/2/3是被Slit2拉下（pulldown）的跨膜蛋白之一。为了确定Robo2的突触生成功能是否需要突触前Neurexin，他们在表达Robo2的HEK293细胞中敲低了Neurexin，发现Neurexin1/2/3下调完全消除了Robo2的突触活性。表面等离子共振表明Slits和Neurexin并无任何直接的相互作用；当Neurexin的Ig4-5结构域被删除时，Robo2与Neurexin的结合效率显著降低，提示Robo2上的Slit（Ig1-2）和Neurexin（Ig4-5）的结合位点可能没有重叠。这些结果表明存在一个Robo-Slit-Neurexin跨突触复合物，促进兴奋性（而不是抑制性）突触的形成（图2）。
图2 Robo2是突触前Neurexin反式异亲性复合物的一部分
（图源：Blockus, H. et al., Cell Reports, 2021）
最后，他们研究了干扰CA1 PNs 中Robo2依赖的兴奋性突触的发育是否会影响其在体内的功能活动模式。结果发现，与野生型小鼠CA1 PNs相比，Robo2敲除小鼠CA1 PNs在运动（running）过程中显著降低了事件频率、位置细胞比例显著减少、峰值活性的特异性显著增加、具有Robo2敲除显著空间信息的PNs的比例也有所增加（图3）。这些数据表明，Robo2的缺失会改变CA1 PNs在体内的位置细胞特性。换言之，CA2/CA3在驱动CA1 PNs持续的位置特异性放电和位置编码中发挥重要作用，突触发育改变对觉醒-行为小鼠海马CA1 PNs的体内特性有重要影响。
图3 Robo2敲除改变了CA1 PNs在体内的位置细胞特性
（图源：Blockus, H. et al., Cell Reports, 2021）
图4 文章模式图：轴突引导分子Robo2的突触发生活性是海马回路功能的基础
（图源：Blockus, H. et al., Cell Reports, 2021）
该研究发现了轴突导向分子Slit和Robo在海马CA1 PNs兴奋性突触形成和突触特异性中的作用，突触后Robo2通过与含有LRR结构域的Slit配体和突触前Neurexin形成跨突触复合体，促进兴奋性（而不是抑制性）突触的形成。而且，缺乏Robo2的单个CA1 PNs显示出改变的位置细胞特性。这些结果揭示了Robo信号在突触形成中的功能，并将突触特异性的建立与CA1 PNs中位置细胞特性的出现联系起来，这对海马回路功能有意义。
然而，这些研究结果是基于体外突触发生实验，未来的工作将需要测试Slit/Neurexin与突触后Robo结合的突触发生活性在体内的相关性。此外，Robo2依赖的突触发生中，Slit的细胞和空间来源仍然是一个有待解决的问题。在海马中，Slit2的表达局限于CA3、CA1 PNs突触前，而Slit1和Slit3在CA区域的表达更广泛。在未来的实验中，进一步理解 Robo-Slit-Neurexin跨突触复合物的结构来解析这些蛋白质的相互作用，以便进一步证明这种模型作为一种增加突触特异性的机制。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109828
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制版︱王思珍
本文完