PNAS︱陈斯杰课题组开发新型聚集诱导发光探针用于坐骨神经和脑组织三维髓鞘荧光成像
撰文︱吴明雨，甘泉，陈斯杰
责编︱王思珍
髓鞘（myelin），作为神经元重要的结构，在神经系统中具有举足轻重的地位[1, 2]。髓鞘作为轴突的「绝缘体」，不仅调控神经冲动的跳跃式传导和动作电位的传导速度，还在调节轴突运输和防止轴突变性等方面发挥重要作用[3]。研究发现，髓鞘丢失和神经胶质细胞功能障碍会导致包括多发性硬化症、脑白质营养不良、肌萎缩性侧索硬化症在内的众多神经系统疾病[4-6]。作为大脑和脊髓最基本和强大的内源性修复机制，中枢神经系统的再髓鞘化是脱髓鞘疾病的主要治疗策略[7]。因此，开发髓鞘成像工具及相应成像技术可以用于研究、检测、病理诊断和治疗评估髓鞘疾病[8, 9]。
荧光成像技术可以提供非常高的时空分辨率，尤其是利用小分子荧光探针的荧光成像，具有非侵入性、低成本、易于使用和可靠等优点[10]。然而目前市售的髓鞘荧光探针，如Vybrant DiD (DiD)、FluoroMyelin Green/Red、存在背景高、对比度低和组织渗透性差等缺点[11-16]。因此，开发具有高特异度、高信噪比、良好组织渗透性和兼容组织光学透明技术的髓鞘成像荧光探针极为重要。
聚集诱导发光（aggregation-induced emission，AIE）荧光探针自其概念提出以来就受到了广泛关注。AIE荧光探针在稀溶液中无荧光，而在聚集态或与目标分子结合后实现荧光点亮[17]，因此可以很好的解决传统荧光探针的荧光亮度低、光稳定性差和选择性不足等问题[18]。目前AIE荧光探针在肿瘤、血管和淋巴等组织的生物成像已经得到了较好的展示[19]，然而该类探针于脑组织荧光成像中尚未被开发。故此开发一种近红外并可用于高质量三维脑组织成像的AIE探针具有重要意义。
2021年11月9日，瑞典卡罗琳医学院（Karolinska Institutet）刘鸣炜复修医学中心的陈斯杰课题组在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上发表了题为“A near-infrared AIE fluorescent probe for myelin imaging: From sciatic nerve to the optically cleared brain tissue in 3D ”的研究论文。作者通过质膜靶向的策略，开发了一种近红外AIE探针——PM-ML——用于髓鞘高信噪比荧光成像。卡罗琳医学院、西南交通大学的吴明雨博士和卡罗琳医学院的Alex Y. H. Wong为论文共同第一作者。
髓鞘是一种由神经胶质细胞包裹在神经元轴突外多于40层致密的质膜，其脂质含量高达70%以上[20]。因此，基于髓鞘的多层膜结构特性，设计合成具有两亲性结构特征的AIE荧光探针，可以与磷脂双分子层通过疏水作用和静电作用实现质膜靶向性，从而提高探针的髓鞘选择性和成像的信噪比。因此，探针的整体设计策略包括以下三点：（1）近红外发光，（2）质膜靶向，（3）具有非平面结构的AIE性能。作者选择了具有典型D-p-A结构的分子骨架，并在电子给体和双键之间加上双噻吩基团，从而设计出近红外发光的探针PM-ML。探针的扭曲构型满足了AIE的基本条件。电子给体和p共轭体系具有强的疏水性，可以嵌入到磷脂的非极性尾部；而亲水的电子供体吡啶盐带有正电荷，可以与带负电荷的磷脂头部发生静电作用，从而实现质膜靶向性（图1 A）。通过一步简单的缩合反应，目标探针的产率可以高达86%。
图1 PM-ML的结构示意图及其光学性质
（图源：Wu M.-Y, et al., PNAS, 2021）
随后作者对其光学性质进行了表征。PM-ML的最大吸收和发射波长分别在495 nm和708 nm，拥有高达203 nm的斯托克斯位移（图1 B）；它表现出明显的AIE性能（图1 C, D），荧光量子产率由0.05%提高到8.5%。PM-ML在与细胞膜脂质模型磷脂DOPC和POPC结合后嵌入磷脂双分子层中，荧光分别增强了94.1和196.8倍（图 1F）。PM-ML与具有疏水空腔的牛血清白蛋白结合非常弱，二者混合后荧光仅有稍微增强，证明了探针与脂质结合的选择性较强。细胞实验进一步证实了PM-ML具有良好的质膜靶向能力（图2）。当用PM-ML对多种活细胞或固定后的细胞进行染色后，可以看到PM-ML与细胞质膜选择性结合，并表现出良好的光稳定性，远远优于商业的细胞膜染料CellMask Green。
图2 PM-ML标记细胞质膜
（图源：Wu M.-Y, et al., PNAS, 2021）
在周围神经系统中，雪旺细胞负责包裹坐骨神经纤维而形成多层膜结构的髓鞘（图3 A）。作者利用PM-ML荧光染色观察了坐骨神经纤维的髓鞘，在共聚焦显微镜下，PM-ML可以清楚标示神经纤维的轮廓（图3 B, C），并进一步显示出有髓神经纤维上特殊的组织结构如施-兰切迹（Schmidt–Lanterman Incisures）和郎飞氏结（node of Ranvier）[21]。
图3 PM-ML标记PNS的坐骨神经纤维中的髓鞘并显示出施-兰切迹和郎飞氏结。
（图源：Wu M.-Y, et al., PNAS, 2021）
为了进一步验证PM-ML在中枢神经系统中标记髓鞘的能力，作者用PM-ML和商业髓鞘探针FluoroMyelin Green对富含髓鞘神经纤维的胼胝体（CC）或小脑（CB）的冷冻切片进行共染色。共聚焦成像显示，两个探针的荧光信号能够很好的重叠，皮尔逊相关系数在0.96以上，这进一步证实了靶向质膜的设计策略可以实现髓鞘选择性标记（图4 A）。与商业的髓鞘探针FluoroMyelin Green/Red和DiD相比，PM-ML具有更加优越的性能，包括更高的亮度、更好的组织渗透性、更高的信噪比和更低的组织背景干扰等（图4B）。尤其是在经组织透明化处理的P18小鼠脑片中，PM-ML表现出远优于FluoroMyelin Green/Red的信噪比，其三维成像可以清楚显示成束状的神经纤维（图4 C）。
图4 PM-ML选择性标记经过组织透明化处理的小鼠脑切片中的髓鞘并显示出比商业髓鞘探针FluoroMyelin Green/Red和DiD更高的信噪比。
（图源：Wu M.-Y, et al., PNAS, 2021）
随后作者将PM-ML用于成年小鼠全脑组织染色及进行有髓神经纤维的三维荧光成像。作者使用PM-ML对1mm厚并经过组织透明化处理的小鼠的矢状脑切片进行髓磷脂标记，通过图像三维重建显示出大脑不同区域的髓鞘结构和形态特征，对大脑的有髓神经纤维进行精细分析（图5）。以上结果表明PM-ML作为一种可靠的髓鞘探针，可以无差别地标记在大脑不同区域中的有髓神经纤维。同时，PM-ML可以兼容多种脑组织光学透明处理方法，具有很好的组织渗透性；在单光子三维成像和双光子三维成像中可以分别达到417 nm（图5 E）和900 nm的穿透深度。而且，经PM-ML染色的组织在常温下可以保存长达5个月以上而仍旧保持良好的荧光亮度，且对髓鞘具有很好的选择性；而商业髓鞘探针FluoroMyelin Red则在4°C保存21天后对髓鞘几乎没有任何选择性。
图5 PM-ML用于光学透明的完整脑组织可以无差别地标记和成像所有区域的有髓神经纤维。
（图源：Wu M.-Y, et al., PNAS, 2021）
最后，作者将PM-ML用于shiverer小鼠模型中脑切片的髓鞘成像，以验证PM-ML在研究脱髓鞘疾病的实际应用（图6）。由于shiverer小鼠敲除了与神经髓鞘化相关的髓鞘碱性蛋白（MBP）基因，因而该小鼠中枢神经系统的髓鞘化减少[22]。通过PM-ML染色后与野生型小鼠的小脑相比，MBP基因敲除小鼠的杂合子（Mbpshi/Mbp+）表现出明显更低的PM-ML荧光信号，而MBP基因敲除小鼠的同型子（Mbpshi/Mbpshi）则几乎没有荧光。这些PM-ML标记模式与shiverer小鼠的低髓鞘化表型密切相关，从而证明了PM-ML可用于评估髓鞘化疾病。
图6 PM-ML用于shiverer小鼠模型中脑切片的髓鞘成像（PM-ML染色髓鞘，Hoechst 33342染色小脑颗粒细胞）。
（图源：Wu M.-Y, et al., PNAS, 2021）
PM-ML适用于高穿透深度的髓鞘和神经纤维束的三维可视化，可用于研究神经病理学及评估动物的髓鞘形成。该研究不仅为设计开发新的髓鞘荧光探针提供理论指导，也为开发出更多可用于神经成像的AIE探针提供依据。通过利用新型造影剂和相关技术，我们能够获得高分辨率、高对比度的神经系统结构图像，从而更深入地了解大脑的组织和功能。PM-ML作为一种多功能且可靠的荧光探针，可以标识中枢神经系统和周围神经系统的有髓神经纤维。它可以为研究人员提供更清晰及高信噪比的图像，以便更好地分析髓鞘密度、束状、纤维束轨迹以及单个有髓神经纤维的详细形态。PM-ML同时在神经学研究中具有很大的潜力，可以揭示髓鞘在发育、疾病进展或治疗过程中细微的重塑；为三维重建有髓神经网络和理解脱髓鞘疾的病病理生理学提供非常重要的研究工具。
原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2106143118
吴明雨博士（第一排左一）和Alex Y. H. Wong（第二排左一）为共同第一作者；陈斯杰博士（第一排中间）为通讯作者。
（照片提供自：陈斯杰博士实验室）
本研究得到卡罗林斯卡医学院刘鸣炜复修医学中心的启动资金、国家自然科学基金（22177094、 21708030）、四川省科技厅应用基础研究（2021YJ0397）、大学教育资助委员会卓越学科领域计划（AoE/M-604/16）、广州市脑科学重点项目（20200730009）、南方海洋科学与工程广东省实验室香港分院（SMSEGL20SC01）和刘鸣炜复修医学中心（MWLC19SC03）的支持。
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参考文献（上下滑动查看）
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制版︱王思珍
本文完