Neurosci Bull丨徐广银课题组揭示通过DNA甲基化靶向脊髓星形胶质细胞中GATA1与P2x7r结合以缓解内脏痛的新机制
撰文︱吴艳艳，胡淑芬，徐广银
责编︱王思珍
肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种病因不明的胃肠道疾病，其特征是广泛的慢性腹痛与肠运动改变。越来越多的证据表明，新生儿期的损伤和炎症对成人体组织结构和功能有长期影响，可能容易诱发胃肠道疾病。目前全世界有25%的人口报告了IBS样的慢性内脏疼痛症状，但科学家们对这一疾病的神经生物学基础的科学研究和治疗手段相当有限。研究认为发育时期的不良刺激（如损伤和炎症）可能导致神经系统疾病，包括慢性神经系统疾病、慢性内脏疼痛等[1]，但其机制尚不清楚。
DNA甲基化在调节基因转录中的影响现在被认为是维持正常身体功能的关键。DNA甲基化的破坏会引发许多疾病，包括发育性疾病、炎症和慢性疼痛[2, 3]。新出现的证据表明，DNA甲基化和去甲基化都参与了外周和中枢神经系统的痛觉和抗痛觉过程。其他研究表明，外周神经系统中转录因子和去甲基化基因启动子相互作用的促进影响神经性疼痛和胃痛觉过敏[4, 5]。然而，在慢性内脏疼痛中，转录因子的选择性结合与DNA甲基化调控之间的关系尚不清楚。
GATA1是一种典型的谱系限制性转录因子，通过协同调控BCL-XL、FOG1等关键分子发挥调控红系和巨核细胞正常分化、增殖和凋亡的作用。此外，据报道，GATA1的上调可负调控突触基因，而GATA1的上调与重度抑郁症相关。然而，GATA1介导的调控机制尚不清楚。值得注意的是，据报道，GATA1在细胞通过有丝分裂时参与了基因表达的精确调控，并且GATA1的选择性结合被认为是由组蛋白修饰H3K4me1介导的[6]，表明GATA1参与了表观遗传调控过程。与此相一致的是，最近的一项研究报道，染色质的改变，包括H3K27me3，参与了Gata1突变相关的Diamond-Black-fan贫血的发病机制[7]。然而，GATA1可能通过何种相互作用影响DNA去甲基化仍然是未知的。
瞟呤能P2X受体（P2XRs）在已有的研究中被证实在大鼠IBS模型中背根神经节（DRG）神经元具有致敏作用，其中包括外周神经系统中P2X在慢性内脏痛中发挥作用[8]。值得注意的是，与其他嘌呤能受体亚型相比，P2X7Rs具有几个不同的特征，并且P2X7Rs已被证明影响神经生理学和神经病理学的许多方面，包括神经递质释放、神经炎症、神经变性疾病和神经性疼痛。据报道，P2X7Rs在肠道炎症中也有作用，并且与慢性内脏疼痛的发展有关[9]。最近，在一个成年大鼠慢性内脏痛模型中，新生期母爱剥夺已被证明增加了P2X7R的表达，并增强了岛叶皮质突触传递[10]。然而，这种痛觉过敏相关的调节机制尚不清楚。
2021年12月10日，苏州大学神经科学研究所的徐广银教授团队在《神经科学通报》（Neuroscience Bulletin）上在线发表了题为“Targeting GATA1 and P2x7r Locus Binding in Spinal Astrocytes Suppresses Chronic Visceral Pain by Promoting DNA Demethylation”的研究论文，深入探究了靶向脊髓星形胶质细胞中GATA1与P2x7r 基因的结合能力及其介导的DNA甲基化来缓解慢性内脏疼痛的作用机制。吴艳艳、张海龙和鲁小敏为论文共同第一作者，徐广银教授和张平安副研究员为论文共同通讯作者。
该研究首先通过免疫荧光的方法发现了与对照组相比，新生儿结肠炎症（neonatal colonic inflammation，NCI）大鼠表现出明显的脊髓星形胶质细胞活化；未检测到小胶质细胞或神经元的激活。药理学实验进一步发现，星形胶质细胞激活抑制剂氟柠檬酸盐处理，发现自发兴奋性突触后电流（sEPSCs）的频率显著降低。重要的是，氟柠檬酸盐对NCI大鼠的应用逆转了结直肠扩张（CRD）阈值，这是以剂量和时间依赖的方式进行的。以上结果提示：脊髓星形胶质细胞促进了脊髓突触传递的增加，从而有助于解释NCI模型大鼠慢性内脏疼痛的增加（图1）。
图1 脊髓星形胶质细胞激活导致NCI大鼠慢性内脏疼痛
（图源：Wu, et al., Neurosci Bull, 2021）
星形胶质细胞激活因子包括P2X7R、TGFa、OSM、CNTF、IL-6和LIF。qPCR检测结果显示，NCI大鼠模型的T13-L2脊髓背角中P2x7r的表达较对照组明显上调。鉴于发现P2X7R特异性地积累在NCI大鼠的背角星形胶质细胞中，接下来使用P2X7R选择性抑制剂A438079来研究P2X7R在星形胶质细胞激活和慢性内脏疼痛中的潜在功能影响。鞘内注射A438079显著减少脊髓星形胶质细胞数量。此外，膜片钳记录显示，在A438079孵育后，脊髓sEPSC频率降低；然而，sEPSC振幅没有变化。与对照组相比，鞘内注射A438079提高了NCI大鼠的CRD阈值，这是一种剂量和时间依赖性的方式。以上结果表明：P2X7R在脊髓星形胶质细胞的激活中发挥作用，它增强突触传递并促进NCI诱导的慢性内脏疼痛的发展（图2）。
图2 NCI大鼠脊髓背角星形胶质细胞P2X7R积累导致慢性内脏痛
（图源：Wu, et al., Neurosci Bull, 2021）
DNA甲基化是基于表观遗传学的基因调控的一个基本方面，本研究在脊髓背角星形胶质细胞中发现了较高的P2X7R水平，进一步预测了在P2X7R 启动区域存在两个富集的CpG岛。最终选定包含7个CG位点的候选CpG2岛，因为它位于P2x7r转录起始位点（TSS）附近。NCI样本中甲基化和未甲基化CpG位点的比例明显低于对照组，表明NCI大鼠脊髓背角中P2x7r 启动子区域TSS邻近的CpG岛发生去甲基化。因此，P2x7r启动子TSS邻近的CpG2岛的去甲基化可能有助于NCI大鼠背角P2x7r的表达上调（图3）。
图3 NCI大鼠p2x7rlocus的CpG岛甲基化程度降低
（图源：Wu, et al., Neurosci Bull, 2021）
DNA甲基化是由DNA甲基转移酶和去甲基化酶介导的。众所周知，TETs是的DNA羟甲基化酶。本研究使用免疫印迹（western blotting）检测了NCI和对照组大鼠脊髓背角中TET1、TET2和TET3蛋白的表达。与对照组相比，NCI大鼠背角TET2和TET3水平上调，但TET1未上调。重要的是，免疫荧光分析发现TET3在背角星形胶质细胞中表达，而TET2不表达。然而，NCI大鼠背角的甲基转移酶（DNMT1、DNMT3a和DNMT3b） mRNA水平没有变化。此外，作者进一步研究了tet3诱导的P2x7r CpG岛去甲基化的作用。单独转染siRNA-TET3到PC12细胞显著降低了P2x7r位点的转录，同时也增加了P2x7r CpG岛的DNA甲基化程度。TET3的拮抗剂DMOG孵育脊髓片后，脊髓sEPSC频率降低，DMOG鞘内注射显著提高NCI模型大鼠的CRD阈值，并呈剂量和时间依赖性。以上结果表明TET3在功能上促进了NCI大鼠的脊髓突触传递增强（图4）。
图4 脊髓星形胶质细胞TET3上调导致慢性内脏疼痛
（图源：Wu, et al., Neurosci Bull, 2021）
为了进一步评估GATA1在P2x7r位点的参与，本研究使用HEK293T细胞进行了荧光素酶报告基因检测。与单独表达去甲基化P2x7r-pgl6的细胞相比，共同表达GATA1和去甲基化P2x7r-pgl6的细胞荧光素酶活性显著增强。为了研究GATA1-P2x7r启动子在体内结合的潜在影响，本研究设计并合成了一个包含特定GATA1结合位点的诱饵ODN。发现ODN处理降低了P2x7r mRNA水平。这些结果表明，GATA1结合在P2x7r位点影响P2x7r CpG岛的甲基化。然而，GATA1调控P2x7r位点甲基化的方式尚不清楚。有趣的是，联合免疫沉淀试验揭示了GATA1在脊髓背角与TET3的物理交互能力；研究还发现NCI大鼠比对照组更容易发生GATA1-TET3结合。以上结果表明物理上的GATA1-TET3相互作用调控P2x7r位点CpG岛的DNA甲基化。膜片钳分析显示，NCI大鼠每日鞘内注射诱饵ODN一周后，脊髓sEPSC频率降低。此外，鞘内注射诱饵ODN显著提高了NCI大鼠的CRD阈值。这些结果表明阻断GATA1在P2x7r位点的结合，通过DNA甲基化介导的P2x7r转录的降低，缓解NCI大鼠的慢性内脏疼痛（图5）。
图5 脊髓星形胶质细胞中GATA1与p2x7rlocus结合增强导致慢性内脏疼痛
（图源：Wu, et al., Neurosci Bull, 2021）
免疫荧光分析显示GFAP阳性星形胶质细胞中GATA1的积累增加，而CD11b染色的小胶质细胞或neun标记的神经元中没有增加。上述研究结果提示，星形胶质细胞中GATA1的上调可能在NCI大鼠的慢性内脏痛中起作用。因此本研究通过设计siRNA特异性敲除NCI大鼠的GATA1表达来对此进行研究。值得注意的是，siRNA介导的GATA1基因敲低降低了免疫荧光分析评估的激活星形胶质细胞数量。此外，转染PC12细胞的siRNA-GATA1提高了P2x7r mRNA水平，而不影响TET3的表达，这支持了上述结果，GATA1结合促进了P2x7r 位点的体外转录。值得注意的是，转染siRNA-GATA1显著降低了P2x7r CpG岛的DNA去甲基化程度，进一步证实了GATA1在调节P2x7r 位点甲基化水平中的必要作用。此外，膜片钳记录显示，GATA1敲低的NCI大鼠sEPSCs的频率和振幅均显著降低。这些数据共同表明，NCI大鼠背角星形胶质细胞中GATA1的增加与慢性内脏疼痛密切相关（图6）。
图6 脊髓星形胶质细胞GATA1的上调与慢性内脏疼痛有关
（图源：Wu, et al., Neurosci Bull, 2021）
图7 NCI诱发慢性痛的假设
（图源：Wu, et al., Neurosci Bull, 2021）
在NCI模型大鼠中，GATA1促进P2x7r基因的DNA去甲基化，可能是通过与TET3去甲基化酶的直接物理作用介导的，显然对慢性内脏疼痛的发展具有调节作用。虽然这一机制还需要在其他动物模型中进一步证实（例如应激诱导的慢性内脏疼痛模型），但该作者的研究结果提供了一种可能的潜在治疗策略，即靶向GATA1和P2x7r位点结合在肠易激综合征等胃肠道疾病患者的临床管理中。
本研究的结果为支持表观遗传机制在慢性疼痛病理生理中的作用提供了进一步的证据。
原文链接：https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs12264-021-00799-1
吴艳艳（第1排左3）、张海龙（第1排左2）和鲁小敏为论文共同第一作者，徐广银教授（第1排右3）和张平安副研究员（第1排右1）为论文共同通讯作者。
（照片提供自徐广银实验室）
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参考文献（上下滑动查看）
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制版︱王思珍
本文完