PNAS︱韩春课题组揭示外部吞噬引发神经元退化的新机制
撰文︱姬卉，韩春
责编︱王思珍
物理损伤通常会导致神经元轴突及树突失去功能。远离神经元胞体的受损神经突会经历一系列被称为沃勒变性（Wallerian degeneration，WD）的改变[1-3]，在此过程中受损神经突破碎并最终被周围的吞噬细胞清理[4]。神经元碎片清理不及时会阻碍神经突再生并导致神经炎症和其他次生伤害[5, 6]。
尽管轴突和树突的沃勒变性通常被认为是神经元内源性的 “自我毁灭”过程，吞噬细胞仅在神经突碎片化后起到清理作用[7]，但吞噬细胞是否积极参与神经突碎片化这一过程，目前仍未知。
烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶（nicotinamide mononucleotide adenyltransferase，Nmnat）是WD通路中的重要一员。Nmnat负责烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的体内合成，对神经元具有保护作用[8, 9]。Nmnat缺失导致的NAD+水平下降可激发下游蛋白Sarm的NAD+水解酶活性，进一步降低NAD+水平并引发“自毁程序”[10-15]。相对地，针对神经突的吞噬作用是通过吞噬细胞上的吞噬受体识别受损神经元表面上的“吃我”信号（“eat-me” signal）而完成的[7, 16-18]。作者此前的研究发现丝氨酸磷脂（phosphatidylserine，PS）外翻是一种神经元上引发吞噬作用的 “eat-me” signal [18]。此项工作旨在探究WD通路是否也调控PS外翻，而且是否吞噬作用积极参与神经突碎片化。
2022年1月25日，美国康奈尔大学的韩春课题组在《美国科学院院报》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, PNAS）上发表了题为“Phagocytosis and self-destruction break down dendrites of Drosophila sensory neurons at distinct steps of Wallerian degeneration”的研究论文。作者发现神经树突在受损或是Nmnat突变情况下会在细胞表面展示 “eat-me” signal。此信号引发周边吞噬细胞主动攻击树突，导致树突碎片化，神经元“自毁程序”继而启动以保证树突的有效清除。该文在细胞水平上丰富了我们对神经元退化机理的理解，首次提出了吞噬作用在受损神经元清除中的主动作用。
为了研究WD通路是否引发吞噬作用，作者以果蝇幼虫感觉神经元（dendritic arborization neurons，da neurons）为模型，结合活体成像和特异组织内基因编辑技术（clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-mediated tissue-restricted mutagenesis，CRISPR-TRiM）开展了以下研究。
首先作者观察了敲除Nmnat后神经元的退化现象（图1 A-B，G-H），并确认了该退化依赖于NAD+水平的下降（图1 C-D，G-H）及Sarm（图1 E-F，G-H）的激活。
图1 Nmnat敲除引发神经元退化，此退化依赖于Sarm活性
（图源：Ji, H., Sapar, M., et al., PNAS, 2022）
接下来，作者利用可遗传编码的探针观察到PS在Nmnat敲除后的神经元细胞膜上外翻（图2 A-C）。抑制PS外翻或抑制吞噬作用都能有效防止Nmnat敲除神经元的退化（图2 D-L）。该结果证明PS介导的吞噬作用是Nmnat敲除神经元退化的主要原因。
图2 PS介导的吞噬作用是Nmnat敲除神经元退化的主要原因
（图源：Ji, H., Sapar, M., et al., PNAS, 2022）
此前研究表明，受损退化的树突也伴有PS外翻现象[18]。在此，为了探究PS外翻是否由WD通路调控，作者用高强度激光分别损伤Sarm敲除神经元树突和Nmnat融合蛋白WldS过表达神经元树突，发现受损树突上的PS外翻现象和碎片样变化皆被抑制（图3）。此结果表明Nmnat和Sarm在上游调控受损树突上的PS外翻。
图3 WldS过表达及Sarm敲除抑制了受损树突的PS外翻以及碎片化
（图源：Ji, H., Sapar, M., et al., PNAS, 2022）
接下来，作者猜想，PS外翻介导的吞噬作用可以导致受损树突碎片化。为了验证其充分性，作者在Sarm敲除神经元以及WldS过表达神经元中通过遗传调控PS转运蛋白方式使PS异位外翻。具有PS外翻的受损Sarm敲除神经元以及WldS过表达神经元都表现出近乎受损野生型神经元的碎片样变化（图4）。这一结果揭示PS介导的吞噬作用对受损神经元退化起到重要作用。
图4 引入PS外翻使得受损的WldS过表达神经元及Sarm敲除神经元树突正常碎片化
（图源：Ji, H., Sapar, M., et al., PNAS, 2022）
同时，作者发现，与Nmnat敲除引发的退化完全依赖于吞噬作用（图2 E-L）相比，受损树突的退化并不以吞噬作用作为唯一推动力。在WD进展到比PS外翻更严重的程度时，抑制吞噬作用无法完全抑制受损神经元以及Sarm过度激活神经元的退化（图5），说明此时神经元的“自我毁灭”程序已成为继吞噬作用后主要的神经元退化驱动力。
图5受损神经元及Sarm过度激活神经元经历不依赖于吞噬作用的退化
（图源：Ji, H., Sapar, M., et al., PNAS, 2022）
为了探究WD通路中的其他分子对神经元退化的影响，作者敲除了在轴突退化研究中被证实有集成作用的Axondead（Axed）基因并损伤树突。结果表明，Axed并不能完全控制受损神经突的退化，也并不调节PS外翻，而是与吞噬作用协同促进受损树突的退化（图6）。
图6 Axed介导的“自我毁灭”程序与吞噬作用协同促进受损树突的退化
（图源：Ji, H., Sapar, M., et al., PNAS, 2022）
为了进一步研究受损树突的退化机理，作者比较了在敲除Nmnat情况下，以及在受损情况下，树突细胞膜的碎裂特点。作者创造了一种基于分裂式绿色荧光蛋白（split GFP）的可遗传编码探针，以便于在活体成像中观察到细小的细胞膜碎裂（图7 A）。结果表明，只有受损树突会在退化过程中发生细胞膜碎裂，而敲除Nmnat神经元的树突的退化不经历细胞膜碎裂这一过程（图7 B-F），进一步暗示敲除Nmnat导致的树突退化主要是通过吞噬作用完成的，而受损树突的退化更加剧烈。
图7 受损树突经历了细胞膜碎裂过程
（图源：Ji, H., Sapar, M., et al., PNAS, 2022）
最后，作者结合活体钙成像和长时程成像，发现了受损树突内独特的钙离子动态变化。受损后，钙离子水平经历快速反复升降期-静息期-二次上升期直到树突碎裂（图8 A-D）。WldS和Axed均对此钙离子动态有调控作用（图 E-L），暗示钙离子变化规律可能是调控受损树突退化的一个因素。
图8 受损树突内独特的钙离子动态
（图源：Ji, H., Sapar, M., et al., PNAS, 2022）
这项研究也存在未解决的问题，例如受损WD通路引发的“自毁程序”和吞噬作用是否能涵盖所有导致受损神经元退化的机理？作者在树突中发现的现象是否在轴突中同样存在？
总之，该研究首次发现神经元周边的吞噬细胞对神经元退化的促进作用，也提示了神经退行性疾病发生的潜在机理。
原文链接：https://www.pnas.org/content/119/4/e2111818119
实验室合照：第一作者姬卉（前排左三），第一作者Maria Sapar（前排左一），通讯作者韩春（后排左一）
（照片提供自：韩春实验室）
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参考文献（上下滑动查看）
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制版︱王思珍
本文完