Sci Adv︱陈忠团队提出癫痫药物治疗新思路：电响应型聚多巴胺纳米递药系统

撰文︱吴   迪

责编︱王思珍

癫痫（epilepsy）是一种由于脑内神经元异常的超同步化放电所导致的严重的中枢神经系统疾病，其全球发病率约为0.7-1 %，我国约有900万的癫痫患者。癫痫发作时主要表现为反复不自主的抽搐、意识丧失，还经常伴发多种神经精神障碍如焦虑和抑郁等，甚至会导致猝死，给患者及其家属带来了极大的社会和心理负担，具有病程长、发病急、易反复的发作特点[1, 2]。传统学说认为癫痫的发病机制与脑内的兴奋抑制系统的失衡相关，兴奋性系统的过度兴奋和抑制性系统的过度被抑制都可能导致癫痫的发生。目前临床所用的抗癫痫药也多是针对该理论，如电压门控型钠通道阻滞剂苯妥英钠、丙戊酸钠和卡马西平，作用于脑内抑制性γ氨基丁酸（γ-aminobutyric acid）受体增加氯离子内流从而产生超极化的苯二氮卓类药物等。但是在实际临床治疗中，约有30%的癫痫患者存在药物控制不良、单药甚至多药耐药的情况[3, 4]。同时，由于癫痫发作时间的反复性以及不可预知性，目前所有患者均需要长期、定时地服用抗癫痫药物，以达到预防性控制发作症状的目的。由于不少抗癫痫药物的治疗指数低，这种长期服药也会进一步不仅导致毒副作用增加。因此，如何以最低的药物剂量增加癫痫病灶区药物有效浓度并提高疗效，已然成为该领域药物研究的重点科学问题。近年来，随着纳米医药领域的快速发展，纳米递药系统已经成为解决药物富集问题的重要手段之一，其原理为具有特殊结构和功能的纳米粒子以吸附、包裹、偶联等多种方式负载药物分子，通过靶向机制将其递送至目标病灶区，从而提高药物利用率、降低给药剂量。然而，常规纳米递药系统尚无法在癫痫发作的特定时间点“智能”实现药物的自动自主释放，并及时抑制异常放电的形成。那么能否设计一种基于癫痫发作特征响应的释放药物系统从而实现局部富集的治疗方式呢？

2022年01月12日，浙江中医药大学的陈忠教授团队在《Science Advances》发表了题为“Nanoengineered on-demand drug delivery system improves efficacy of pharmacotherapy for epilepsy”的文章。浙江中医药大学副研究员吴迪、浙江大学博士生费凡为共同第一作者，陈忠教授和汪仪研究员为共同通讯作者，浙江中医药大学为第一完成单位。该研究利用多学科交叉技术，针对癫痫发作时大脑异常放电的疾病特征，设计了一种电场敏感且具备联合脑靶向能力的纳米递药系统用于抗癫痫药物的精准递送，为癫痫药物治疗提供了一种新策略和治疗新思路。

该研究在课题组前期构建的脑靶向多肽介导的电场敏感纳米水凝胶递药系统的研究基础上[5，6]，继续深入探究治疗癫痫的高效低毒的智能递药系统。针对抗癫痫药物递送的实际需要，研究设计了一种以聚吡咯-聚多巴胺为主体的纳米材料，在聚吡咯导电材料中引入聚多巴胺，结合“多肽-NIR”联合靶向技术，并充分发挥纳米材料的药物负载、电场响应和光热转化特性，以期提高纳米递药系统的靶向效率、优化其电响应药物释放功能（图1 A, B）。研究以吡咯（pyrrole）和多巴胺（dopamine）分子为单体，在水相体系中加入过硫酸铵作为氧化剂，诱导吡咯和多巴胺共聚形成聚吡咯-聚多巴胺纳米材料。研究选取苯妥英钠作为药物模型进行实验，“一锅法”合成聚吡咯-聚多巴胺-苯妥英（PPY-PDA-PHT）纳米材料，其分散性良好，粒径均一（图1 C, D）。实验检测了PPY-PDA-PHT纳米颗粒的水溶液的紫外-可见-近红外光谱（图1 E）发现纳米材料在近红外光区具有明显的吸收，这为后续通过近红外光刺激促进药物的血脑屏障穿透提供了理论依据。为了促进纳米材料的主动靶向，实验在纳米材料表面修饰了具有脑靶向功能的短链多肽Angiopep-2（ANG）。通过ζ-potential分析，纳米材料的表面电荷在引入聚多巴胺后，电负性增加；而经过ANG-PEG-HS修饰后的纳米材料，表面呈电中性，不易于团聚（图1 G）。实验对比了经过修饰与未经过修饰的纳米材料在血清培养基中的粒径变化。结果表明（图1 H），经过表面修饰的纳米材料在7天内，粒径没有发生明显变化，验证了实验成功修饰了纳米材料，增加了血液长循环，有利于后续整体动物实验。

图1 纳米递药系统的合成与理化性质表征

（图源：Wu D. et al., Sci. Adv., 2022）

对电场敏感并受电刺激后释放药物是提高抗癫痫药物在癫痫发作时及时释放的关键。因此，研究进一步探究了药物负载的纳米材料的电响应性质。实验以铂对电极（1 cm × 1 cm）设计了一套模拟电刺激装置。两片电极之间的距离固定，并没入具有一定离子强度的溶液之中，溶液中有磁子促进药物均匀分散（图2 A）。实验发现，在给予200 μA-10 min的电刺激时，5%多巴胺加入量所合成的PPY-PDA-PHT放出的药物最多（图2 A-C）。通过“四探针法”测定，随着多巴胺加入量的增加，其复合材料的导电性能逐步增加并在5%时达到峰值（图2 C）；5%多巴胺加入量合成的PPY-PDA-PHT的导电系数是聚吡咯导电系数的125倍以上。为了进一步明确聚多巴胺组分对材料电性能的影响，实验通过密度泛函理论模拟了PPY-PDA-PHT的分子模型，计算模拟揭示了引入聚多巴胺后，药物与载体之间的作用力被减弱（图2 D）。考虑到真实材料的三维网络结构，该效应会被明显增强，因此进一步佐证了聚多巴胺可以提高药物释放的灵敏度。实验以5%多巴胺合成的PPY-PDA-PHT，测试了药物释放与电刺激强度、电刺激时间、电刺激方式的关系。实验发现（图2 E-F），最低至50 μA，最快至30 s，即可诱导药物响应释放，并且随着刺激强度的增加、刺激时间的延长，药物释放量增加。更为重要的是，通过采用“开-关-开”的间歇性电刺激，实验发现纳米材料可以实现精准的同步响应释放（图2 G）。这些结果为控制持续性癫痫发作提供了理论基础。

图2 纳米递药系统的药物响应释放和血脑屏障穿透研究

（图源：Wu D. et al., Sci. Adv., 2022）

近年来，有研究报道近红外光刺激具有增加血脑屏障通透性的作用，是一种潜在的非入侵式促进药物脑部递送的新策略[7,8]。因此，在近红外光区具有明显吸收的PPY-PDA-PHT-ANG纳米材料可能具有类似的功效。经计算，PPY-PDA-PHT-ANG的光热转化效率为39.4%，与常见的光热试剂转化效率接近。实验利用小鼠脑微血管内皮细胞构建了体外血脑屏障模型（图2 H）。实验发现，PPY-PDA-PHT-ANG实验组，即仅修饰ANG靶向多肽时，药物的穿透效率为36.8%；PPY-PDA-PHT+NIR实验组，即仅给予光刺激时，药物穿透效率为34.3%；而无任何靶向手段辅助时，药物的穿透效率低于1%。这说明NIR光刺激与ANG靶向多肽修饰均能提高药物的血脑屏障穿透效率（图2 J）。而当同时给予NIR光刺激与ANG靶向多肽修饰（PPY-PDA-PHT-ANG+NIR）时，药物的穿透效率进一步提升至57.8%，验证了靶向多肽修饰和近红外光刺激能同时促进药物穿透血脑屏障。然后，实验进一步通过动物实验验证该系统是否能实现脑部靶向。实验将纳米材料用NIR荧光染料标记，在给予动物不同处理后发现，经过NIR光处理的PPY-PDA-PHT组或是具有主动靶向作用的PPY-PDA-PHT-ANG组均能提高纳米材料在脑部的富集（图3 B）。当二者同时作用时，其纳米材料在脑部的富集是未经处理PPY-PDA-PHT组的400%以上（图3 C）。更为重要的是如图3B所示，大脑切片荧光成像分析表面纳米材料经过NIR与ANG的协同靶向作用后，在癫痫的常见病灶——颞叶区大量富集。

图3 纳米递药系统治疗急性癫痫研究

（图源：Wu D. et al., Sci. Adv., 2022）

为了评价抗癫痫治疗效果，研究首先构建了常用的戊四唑（PTZ）诱导急性小鼠癫痫模型。以实验组为例，随机选取健康小鼠，通过腹腔注射一定剂量的PPY-PDA-PHT-ANG，给药50 min后，给予NIR持续照射10 min（红外热像仪监测确保脑部皮肤温度不超过43°C），然后腹腔注射PTZ诱导小鼠癫痫发作情况。最后观察小鼠行为学情况并通过植入电极的方式记录小鼠脑电（EEG）。行为学结果表明（图3 D-F），在10 mg/kg剂量下，PPY-PDA-PHT-ANG+NIR组与阳性药PHT组相比，癫痫平均发作等级从5.2降至3.8。即使是采用5 mg/kg剂量，与对照组相比也有显著性差异。从大发作潜时来看（图3 D），经过PPY-PDA-PHT-ANG+NIR 10 mg/kg治疗后，GS潜时从199 s提高至1800 s（即30 min观察时间内未出现GS）；而相同剂量的阳性药组的平均潜时为813 s，与对照组之间并无显著性差异。根据文献报道，小鼠癫痫治疗模型中，PHT的有效治疗剂量为50-75 mg/kg [9]。与之相比，本研究所提供的治疗方式大大降低了PHT的使用量，避免了大剂量服药的危害。

为了进一步验证治疗效果的提升来源于脑靶向与电响应药物释放，实验通过微透析分析法实时监测上述治疗过程中小鼠的脑内药物浓度，结果如图3H-J所示。在药物注射后60 min，PPY-PDA-PHT-ANG+NIR 10 mg/kg治疗组的脑内PHT平均浓度为1.07 μg/mL，是PHT 10 mg/kg对照组的2倍以上；PPY-PDA-PHT-ANG 10 mg/kg治疗组的脑内PHT浓度与对照组相比同样有所提高。这充分说明了经过ANG主动靶向与NIR光照刺激能有效提高药物的脑部富集。在PTZ诱导小鼠癫痫发作后，PHT 10 mg/kg对照组的PHT浓度逐步下降，而PPY-PDA-PHT-ANG+NIR 10 mg/kg与PPY-PDA-PHT-ANG 10 mg/kg治疗组的脑内药物浓度在接下来2 h内持续维持在高位。PPY-PDA-PHT-ANG 10 mg/kg治疗组诱导后30 min内的药物浓度是诱导前的3.7倍（图3 J）。该证据直接证明了纳米递药系统在癫痫发作放电的作用下能释放药物，提高脑内药物浓度，响应性抑制癫痫发作。

为了评价纳米递药系统对于持续性癫痫的治疗作用，实验利用Sprague-Dawley（SD）大鼠构建了匹鲁卡品诱导的持续性癫痫模型。实验发现，在给予10 mg/kg的PPY-PDA-PHT-ANG+NIR治疗后，大鼠的GS和SE潜时与空白组（saline）和对照组（PHT-10）相比，均得到了显著性的延长（图4 B, C）。而注射PHT 10 mg/kg，对于持续性癫痫的发作潜时几乎没有影响，说明该剂量下PHT纯品对于持续性癫痫没有治疗作用。能谱图分析表明经过PPY-PDA-PHT-ANG+NIR治疗后（图4 D），脑内电活动情况明显减弱，能量降低，验证了纳米递药系统对于持续性癫痫的疗效。为了更完整地评价纳米递药系统的抗癫痫作用，实验利用C57小鼠构建了海人藻酸诱导的自发性癫痫模型，在已经稳定自发的癫痫小鼠身上进行了验证。结果表明（图4 H-M），在相同PHT给药剂量下，经过纳米递药系统治疗的小鼠的癫痫大发作严重程度明显下降。以上三种不同发作类型的癫痫模型共同验证了该研究所提出的治疗方式具有较好的抗癫痫作用。

图4 纳米递药系统治疗持续性和自发性癫痫研究

（图源：Wu D. et al., Sci. Adv., 2022）

治疗方式的安全性是临床转化的前提。本文分别通过急性、慢性等多种生物安全性测试对治疗方式进行了评价（图5）。实验利用转棒实验、矿场实验考察了纳米递药系统对动物运动神经功能的影响；利用免疫荧光对全脑神经元、小胶质细胞、星型胶质细胞进行了染色与观察，探究纳米递药系统的神经毒性；然后，实验还对给药小鼠的血常规、肝肾功能等血液生化指标进行了测定；最后，通过免疫组化对连续给药后小鼠的主要器官组织进行了观察。以上实验结果均表明，实验组与空白组没有明显差异，验证了通过多肽-NIR协同脑靶向和电响应药物释放的治疗方案没有明显的毒副作用，具有较好的生物安全性。

图5 纳米递药系统的生物安全性评价

（图源：Wu D. et al., Sci. Adv., 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究根据癫痫药物治疗的缺陷，基于聚吡咯-聚多巴胺纳米材料设计了一种新型纳米递药系统用于抗癫痫药物的精准递送，以期提高抗癫痫疗效，减少副作用。针对癫痫发作时快速放电的病理学特征，研究在聚吡咯材料中引入聚多巴胺，提供了一种对癫痫放电敏感的药物释放机制。当癫痫发作时，纳米递药系统可以在30 s内快速释放药物，提高局部药物浓度，并能够持续响应癫痫电信号，抑制持续性癫痫发作。同时，为了提高纳米递药系统的脑部靶向，本文提出了利用多肽主动靶向和NIR光照刺激协同靶向的策略。经过体外、体内实验验证，该策略能够有效提高药物的血脑屏障穿透能力，促进其在脑部的富集。本文采用了多种不同的癫痫模型，成功验证了研究人员提出通过优化靶向机制并引入药物响应释放的治疗方式能够降低癫痫发作严重程度，并具有较好的神经相容性与生物安全性，是一种安全、有效的癫痫治疗方案，为癫痫药物治疗提供了新策略，为新型中枢药物递送系统的设计提供了新的思路。但是，目前鉴于NIR激光发生设备的限制，治疗方案的简便性还有待进一步提高；同时，值得关注的是，目前一线临床抗癫痫药物分子的基础性质各不相同，如何提高纳米递药系统负载药物的普适性对于后期临床转化研究至关重要。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abm3381

本文第一作者为浙江中医药大学副研究员吴迪博士（二排右六），浙江大学博士生费凡为共同第一作者。浙江中医药大学陈忠教授（二排左六）和汪仪研究员（二排左七）为本文的共同通讯作者。浙江中医药大学副研究员徐层林博士（二排左五）、谈贝老师（二排左二）、陈晓劼老师（二排右三）和研究生张琪（一排右二）、郑玉艺（一排左二）也参与了本课题的研究。同时，研究也得到了浙江大学方文军教授、浙江工商大学谢湖均教授等专家的大力支持和帮助。研究得到了国家自然科学基金和中国博士后基金的资助。

（照片提供自：浙江省神经药理学与转化研究重点实验室）

陈忠教授团队长期致力于癫痫、脑卒中、情感障碍等慢性脑病的发病机制及药物靶点发现研究，前期系列研究成果发表于Neuron, Nature Neuroscience, Nature Nanotechnology, Nature Communications, Biological Psychology, Molecular Psychiatry, Journal of Experimental Medicine, Cell Report, Journal of Cell Biology, Annals of Neurology, Progress in Neurobiology, Chemical Society Reviews等国际著名期刊，8篇被F1000推荐，论文被引用超过万次。成果获得国家科技进步二等奖、教育部自然科学一等奖、浙江省自然科学奖一等奖等多项奖励。

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制版︱王思珍

本文完