Nat Neurosci︱刘晶晶等揭示下丘脑黑色素聚集激素对海马-背外侧隔环路活性的调控作用

撰文︱陆   一

责编︱王思珍

在我们大脑中，信息传递主要通过各种神经递质来进行。经典的神经递质都是快速释放的神经递质，主要有兴奋性的谷氨酸（Glu）和抑制性的γ-氨基丁酸（GABA）。同时，大脑中也存在释放比较慢的神经递质，比如神经肽（neuropeptide），它们对突触信息传递和行为有着重要的调控作用[1]。以往对神经肽功能的研究比较少，尤其在环路和行为中的作用，目前还不是很清楚。

黑色素聚集激素（melanin-concentrating hormone，MCH）是一种很重要的神经多肽。在大脑中，表达MCH的神经元主要位于下丘脑外侧区（lateral hypothalamic area，LHA）和未定带（zona incerta）[2]，并且投向大脑广泛区域[3-5]。研究表明，MCH在哺乳动物的大脑中发挥重要功能，包括参与能量稳态、代谢、奖赏、睡眠、学习记忆、社交等过程的调控[6-13]。MCH神经元也能表达其他神经肽，比如内脂素、可卡因和苯丙胺调节转录肽，同时也能释放谷氨酸或γ-氨基丁酸[14-16]。由于MCH在MCH神经元中的作用不是很清楚，所以，MCH在神经元活性、环路或行为中的作用知之甚少。

在神经环路水平上，下丘脑LHA的MCH神经元对背外侧隔（dorsolateral septum，dLS）有相互投射关系，而dLS接受海马神经元的投射。背侧海马（dorsal hippocampus，dHP）的CA3（dCA3）椎体神经元含有编码环境空间信息的位置细胞[17-20]。一项自由活动动物的在体电生理记录的研究显示，MCH神经元的一个亚群在探索行为中有特异性的动作电位发放[21]，表明下丘脑的MCH神经元和背侧海马的位置细胞可以在空间探索行为中共同激活。然而，其中的机制还不清楚，有种可能是MCH神经元以及MCH本身改变了海马-隔核环路的信息传递。

2022年1月3日，美国罗格斯大学罗伯特伍德约翰逊医学院儿童健康研究所的Zhiping Pang团队和纽约大学医学院神经科学研究所的Richard W. Tsien团队合作，在Nature Neuroscience上发表了题为“Hypothalamic melanin-concentrating hormone regulates hippocampus-dorsolateral septum activity”的研究论文，阐述了下丘脑黑色素聚集激素（MCH）对海马-背外侧隔环路活性的调控作用。刘晶晶博士为论文第一作者，Zhiping P. Pang教授为论文通讯作者。在此项研究中，作者发现，MCH的释放可以影响dLS的信息传递，从而增强背侧海马依赖的空间导航作用。MCH神经肽对dLS的信号传递有多重影响，这些独特而又协同的效应使得dLS神经元对于高频的dCA3输入呈现出放电更快的现象，从而导致MCH介导的空间学习记忆的增强。该文从突触到行为水平为我们解释了dLS的神经肽能输入信号是如何调控dHP的神经输出的，从而影响行为状态，进一步丰富了我们对突触可塑性和记忆的认识，揭示了神经肽在大脑信息传递到最终行为呈现的调控作用。

一、MCH能降低dLS-LHA环路神经元的自发放电

已经研究表明dLS对LHA有投射关系[22]。所以LHA的MCH神经元分泌的MCH有可能对dLS的相关环路有调控作用。为了证实这个猜想，作者对LHA中MCH神经元直接进行光遗传学操控。另外，为了证实dLS对LHA的投射关系，作者将microfluorescent RetroBeads注射进同一只MCH-Cre小鼠LHA（图1 a）。病毒注射完2-3周后，进行离体脑片电生理实验，发现，给予LHA 470nm蓝光刺激可以诱发被病毒感染的神经元（MCH神经元）动作电位发放，给光频率可以达到20Hz（图1 b, c），该频率与探索行为中记录到的MCH神经元的生理性放电频率是一致的。MCH神经元对全脑有广泛投射，而对dLS有密集、曲张样投射（图1 d, e）。与以前的研究一致的是，光刺激MCH神经元的 轴突末端能引起dLS神经元中谷氨酸释放介导的兴奋性突触后电流（EPSC）（图1 f），这表明在MCH神经末梢中谷氨酸能突触囊泡有很高的释放概率。

图1 外源性MCH能抑制dLS神经元的自发放电

（图源：JJ Liu, et al., Nat Neurosci, 2022）

dLS含有大量的GABA能投射神经元，这在dLS中形成一个广泛的、局限的轴突丛，这是局部侧抑制或前馈抑制的解剖学基础。确实，光诱发的MCH神经元兴奋性突触后电流（oEPSC）会伴随一个延迟几毫秒的继发性抑制性突触后电流（oFFI-IPSCs）（图2 a, b）。所以，在短时程刺激（10s，10 Hz或20 Hz）中，MCH神经末梢激活对dLS神经元放电的影响是可变的，且这种变化依赖于兴奋性（oEPSC）和抑制性（oFFI-IPSCs）之间的平衡（图2 c-f）。

为了诱导MCH释放且检测神经肽的缓慢作用，作者应用了长时程的光刺激。他们首先检测了给予长时程光刺激MCH神经元纤维后dLS神经元的自发动作电位发放情况。在80s，10 Hz或20 Hz刺激过程中，由于谷氨酸释放很快就衰减了，所以可以被检测到谷氨酸水平很低（图1 f-g）。而在给予长时间光刺激后，dLS神经元自发性放电（sAP）被明显得抑制了，这种抑制作用在光停止后会继续维持几分钟（图1 h-k，图2 g-h）。这种抑制作用是MCH介导的，因为它能被MCH1型受体特异性拮抗剂Tc-MCH7c所逆转。同时，外源性给予MCH也能模拟光刺激MCH神经元纤维对dLS神经元的影响。这些结果表明：MCH释放到dLS中能引起一个延迟的持续的对dLS向LHA投射神经元的放电和兴奋性的抑制作用。

图2 光刺激LHA中对dLS有投射的MCH神经元对dLS神经元自发放电的即时作用

(图源：JJ Liu, et al., Nat Neurosci, 2022）

二、MCH能促进dLS中兴奋性突出输入

尽管MCH神经元在dLS有大量的投射，但有研究显示小鼠中dLS很少有MCH受体的表达[23, 24]。为了进一步确认这一点，作者使用RNAscope原位杂交方法检测了MCH1型受体（MCHR1）在小鼠dLS中的表达情况。结果显示，dLS中几乎没有MCHR1 mRNA的表达（图3 a，图4 a）。所以前面实验发现的MCH对dLS神经元兴奋性的抑制作用不太可能是通过MCH直接作用于突触后dLS神经元上的MCHR1实现的。

图3 MCH能增强dLS神经元的兴奋性突触传递

（图源：JJ Liu, et al., Nat Neurosci, 2022）

接着，作者研究了是否MCH抑制了dLS的兴奋性突触传递，从而降低了dLS神经元的兴奋性。他们首先记录了dLS神经元的自发的兴奋性突触后电位（sEPSC）和电刺激诱发的兴奋性突触后电位（eEPSC），然后检测光刺激MCH神经元纤维前后对这两种电位的影响。结果显示，20Hz光刺激能增强sEPSC和eEPSC（图3 b, c，图4 b）。这种增强作用有可能是MCH介导的突触前谷氨酸释放增加导致的。主要有以下证据：（1）sEPSC的频率增加（图4 b）；（2）AMPA受体（AMPAR）和NMDA受体（NMDAR）介导的eEPSCs的幅度增加，但AMPAR与NMDAR比值没有变化（图3 b, c）；（3）eEPSCs的配对脉冲比（paired-pulse  ratio，PPR）下降（图3 d, e）。并且光刺激MCH神经元纤维对dLS神经元EPSCs的这种影响是可以被MCHR1拮抗剂TC-MCH7c 35或SNAP94847所逆转的（图4 c-e）。另外，外源性MCH（或者MCH类似物[Ala17]-MCH）也能持续增强dLS中投向LHA的神经元的sEPSCs（图5 a-c）。所以，很有可能光刺激导致了内源性MCH的释放，然后MCH激活突触前MCHR1来增强dLS中谷氨酸释放。并且这些效应在表达eYFP的对照组小鼠中并没有发现（图5 d-f），这表明光刺激对神经元的活性没有影响。

图4  MCH通过突触前机制增强dLS-LHA投射神经元的兴奋性突触传递

（图源：JJ Liu, et al., Nat Neurosci, 2022）

为了进一步证明MCH介导了dLS神经元EPSCs增强作用，作者在下丘脑注射了带有shRNA-Pmch的病毒，这种病毒可以抑制MCH的表达（图3 f，图5 g-i）。为了测试shRNA-Pmch抑制MCH表达对功能的影响，作者将shRNA-Pmch-GFP病毒和cre依赖的AAV-C1V1-mCherry病毒混合（3:1）注射入MCH-cre小鼠的LHA。结果显示，与对照组（GFP^-）相比，shRNA-Pmch-GFP细胞的MCH表达明显下降（图3 g）；同时，表达C1V1的MCH神经元中，MCH的表达也有明显下降（图5 j）。并且电生理实验表明，与对照组相比，shRNA-Pmch组动物中，光刺激MCH神经元纤维并不能增强兴奋性突触和降低PPR（图3 h-k，图5 k, l）。从而进一步证明MCH确实介导了dLS神经元EPSCs增强作用。

图5  MCH对dLS神经元兴奋性突触传递的调控作用

（图源：JJ Liu, et al., Nat Neurosci, 2022）

以上实验表明，MCH主要是通过作用于dLS突触前机制来影响dLS神经元的活性，那么dLS的突触前神经元可能存在MCHR1的表达。同时，有研究显示，一个主要dLS兴奋性输入来自于dHP的CA3椎体神经元。所以作者进行了RNAscope原位杂交，发现CA3椎体神经元中有大量MCHR1 mRNA的表达（图6 a，图7 a-c）。所以MCH很有可能调控CA3-dLS这条环路的活性。果然，当Chris ChR2-eYFP表达于CA3椎体神经元后，外源性MCH可以使光刺激诱导HP-dLS环路兴奋性突触强度增加一倍（图6 b-e，图7 d-e），同时PPRs下降（图7 f）。为了证明内源性MCH是否也有类似效应，作者采用了双色光遗传的方法。他们将cre依赖的AAV-C1V1-mCherry和AAV-CamkII-ChR2-eYFP分别注射进MCH-cre小鼠的LHA和CA3，使MCH神经元表达C1V1，CA3椎体神经元表达ChR2（图6 f, g，图7 g, h）。接着进行脑片电生理实验。与外源性MCH效应类似（图6 d, e），在给予590 nm红光刺激后，470 nm蓝光刺激引起的HP-dLS环路中dLS神经元oEPSCs的幅度增加一倍（图6 h, i），以及PPR也显著下降（图6 j, k）。同时这种效应能被MCHR1的拮抗剂所逆转（图7 i, j）。这些实验进一步表明MCH的效应是突触前机制，有可能通过表达在投射到dLS的CA3椎体神经元轴突上的MCHR1来实现的。所以内源性MCH可以增强HP-dLS环路的兴奋性输入。

图6 MCH能增强dHP-dLS环路的兴奋性突触传递

（图源：JJ Liu, et al., Nat Neurosci, 2022）

图7  MCH能促进海马对dLS神经元的兴奋性输入

（图源：JJ Liu, et al., Nat Neurosci, 2022）

三、MCH对dLS的抑制性突触传递的调控作用

虽然MCH可以增强dLS突触前兴奋性输入，但MCH却抑制dLS神经元的自发放电。所以有可能MCH能增强dLS的抑制性突触传递，从而调控dLS的兴奋-抑制突触传递的平衡，最终抑制dLS神经元的放电。为了证实这一点，作者进行了脑片电生理实验。他们发现，长时程光激活dLS中MCH纤维可以显著增加自发性IPSCs（sIPSCs）的频率和电刺激诱发的IPSCs（eIPSCs）的幅度（图8 a-d，图9 a），同时伴随PPR的下降（图8 c , d）。这些效应可以被MCHR1拮抗剂所阻断（图8 c, d，图9 b, c），并且外源性MCH也有这些效应（图9 d, e）。因为前面的结果表明，dLS中几乎没有MCHR1的表达。所以以上结果表明MCH很有可能是增强了来自于其他脑区的长距离抑制性投射来抑制dLS神经元的兴奋性。

正如前面结果所示，dLS存在大量GABA神经元。所以，很有可能存在前馈抑制（FFI）现象。为了证实这一点，作者继续进行电生理实验验证FFI（图8 e）。他们首先在HPCA3椎体神经元中表达ChR2，然后光激活dHP-dLS兴奋性输入来诱导多突触抑制效应。结果显示：CNQX既能抑制光诱导的FFI（oFFI），又能抑制HP-dLS环路兴奋性输入（图8 f），从而证明了oFF的多突触特性。并且，在有MCH的情况下，即使ChR2诱导的HP-dLS EPSCs被增强了，但HP-dLS oFFI却被抑制了（图8 g, h）。这些结果进一步证明MCH是抑制dLS神经元的兴奋性。

图8 MCH介导的抑制性突触传递降低了dLS神经元活性和兴奋性

（图源：JJ Liu, et al., Nat Neurosci, 2022）

接着，作者研究了GABA信号在MCH的抑制效应中的作用。首先，他们使用了GABA_AR拮抗剂picrotoxin（PTX），MCH的抑制效应并没有完全消除。然而，GABA_BR拮抗剂CGP55845可以完全逆转MCH的抑制效应（图8 i, j），表明dLS中突触后的GABA_BR是MCH抑制效应的关键因素。进一步的实验表明，GABA_BR参与了dLS内的突触传递以及HP dCA3传入的oFFI（图8 k-n），表明GABA_BR介导的抑制效应在MCH对dLS神经元放电的调控作用中起着关键性的作用。

以上实验结果整体表明MCH是通过GABA_BR介导dLS神经元的抑制性突触强度的增强作用，从而使dLS神经元的兴奋性下降。

图9  内源性MCH能增强dLS中GABA的活动状态

（图源：JJ Liu, et al., Nat Neurosci, 2022）

四、MCH对dLS神经元高频放电的促进作用

前面的实验阐述了缓慢作用的MCH对GABA和谷氨酸介导的快速突触传递的影响，接下来，作者研究了这种调控效应对整体环路水平的信息传递的作用。背侧海马（dHP）使用高频放电来编码空间信息[17-20]。大部分dHP椎体细胞静息状态放电频率小于2 Hz，但在编码位置信息时放电频率高达50 Hz [25, 26]。另外，这种与位置信息编码的高频放电也与dLS有关[19, 26]。所以，作者研究了海马（HP）输入的频率变化对dLS神经元放电是如何影响的。结果发现，在没有MCH的情况下，由于HP被激活诱导的dLS神经元放电是受限的，无法形成高频放电，这种抑制作用是GABA_BR介导的FFI导致的。在有MCH的情况下，由于HP被激活诱导的dLS神经元可以维持高频放电，这种效应在给予GABA_BR拮抗剂的情况下也可以看到（图10），从而说明，确实是GABA_BR介导了抑制作用。这些结果表明在机体中，dLS作为信息中转站，可以将海马CA3的高频信息往下游传递，GABA_BR介导的FFI是其中的抑制因素，MCH可以移除这个抑制因素，从而保证上游核团高频信息的传递（图10 c）。

图10 MCH可以维持HP-dLS-LHA环路高频编码的信息流

（图源：JJ Liu, et al., Nat Neurosci, 2022）

五、dLS中的MCH可以增强海马依赖的空间记忆

既然MCH可以调控HP-dLS-LHA环路的信息传递，使得海马编码空间的高频信息可以传递下去，那么，这种调控是否可以影响行为？作者接着做了一系列行为学实验来验证这个假设。

作者首先用Morris水迷宫实验来进行空间记忆的检测。通过套管的方法，在双侧dLS中，他们分别给予小鼠dLS MCH受体激动剂[Ala17]-MCH、拮抗剂TC-MCH7c和空白对照，将小鼠分成激动剂组、拮抗剂组和对照组。结果显示，与对照组相比，不管是在平台区域的时间比例、进入平台区域的次数与时间，激动剂组小鼠表现都要更好，而拮抗剂组小鼠表现较差（图11 a-f），这表明MCH可以增强空间记忆的发生。为了进一步验证这一结果，作者使用化学遗传学的方法，在MCH-cre的小鼠dLS分别注射了cre依赖的带有DREADD（兴奋性hM3Dq或抑制性hM4Di）的retro-AAV病毒，使得投射dLS的LHA中MCH神经元表达hM3Dq或hM4Di，腹腔注射CNO后，促进（hM3Dq组小鼠）或抑制（hM4Di组小鼠）MCH释放。注射CNO后进行Morris水迷宫实验，结果显示，与对照组相比，hM3Dq组小鼠有更好的表现，hM4Di组小鼠表现更差，但这三组小鼠运动能力没有差异（图11 g-l），这与前面药理学实验结果一致。因此药理学实验和化学遗传学实验都表明dLS中MCH信号能增强海马依赖的空间记忆。

图11 MCH可以增强海马依赖的空间记忆的维持

（图源：JJ Liu, et al., Nat Neurosci, 2022）

图12 MCH调控海马-隔核神经环路的机制总结

（图源：JJ Liu, et al., Nat Neurosci, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究结合电生理、药理学、光遗传学、化学遗传学、行为学等方法，主要阐述了背侧海马（dHP）CA3-背外侧隔（dLS）神经环路中神经肽黑色素聚集激素（MCH）信号对突触和环路的调控机制（图12）。

本文显示，不管是外源性还是内源性MCH，都可以通过突触前机制，增强dLS中兴奋性（包括CA3输入）和抑制性突触强度。并且，GABA_BR介导的抑制效应在对dLS神经元的兴奋性有着重要作用，同时，dLS内部侧抑制介导的前馈抑制抑制了由海马兴奋性输入诱导的dLS神经元放电频率。MCH调控了这一过程，增加dLS神经元放电的保真度，能够比较准确的反应上游背侧海马的信号输入，从而促进空间学习和记忆的发生。

总之，本研究清晰阐述了缓慢作用的神经肽MCH对经典快速作用的神经递质GABA和谷氨酸介导的突触传递调控作用，以及这种作用对环路信息传递的影响，从而最终影响行为的发生。进一步丰富了我们对神经肽在大脑中的作用机制的认识，也为我们能更好地在突触和环路水平理解大脑工作原理做出贡献。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41593-021-00984-5 

通讯作者Zhiping P. Pang教授（左），第一作者刘晶晶博士（右）

（照片提供自Zhiping Pang实验室）

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1. van den Pol, A. N. Neuropeptide transmission in brain circuits. Neuron 76, 98-115, doi:10.1016/j.neuron.2012.09.014 (2012).

2. Qu, D. et al. A role for melanin-concentrating hormone in the central regulation of feeding behaviour. Nature 380, 243-247, doi:10.1038/380243a0 (1996).

3. Bittencourt, J. C. et al. The melanin-concentrating hormone system of the rat brain: an immuno- and hybridization histochemical characterization. The Journal of comparative neurology 319, 218-245, doi:10.1002/cne.903190204 (1992).

4. Bittencourt, J. C. Anatomical organization of the melanin-concentrating hormone peptide family in the mammalian brain. Gen Comp Endocrinol 172, 185-197, doi:10.1016/j.ygcen.2011.03.028 (2011).

5. Steininger, T. L., Kilduff, T. S., Behan, M., Benca, R. M. & Landry, C. F. Comparison of hypocretin/orexin and melanin-concentrating hormone neurons and axonal projections in the embryonic and postnatal rat brain. J Chem Neuroanat 27, 165-181, doi:10.1016/j.jchemneu.2004.02.007 (2004).

6. Jego, S. et al. Optogenetic identification of a rapid eye movement sleep modulatory circuit in the hypothalamus. Nature neuroscience 16, 1637-1643, doi:10.1038/nn.3522 (2013).

7. Vetrivelan, R. et al. Melanin-concentrating hormone neurons specifically promote rapid eye movement sleep in mice. Neuroscience 336, 102-113, doi:10.1016/j.neuroscience.2016.08.046 (2016).

8. Adamantidis, A. & de Lecea, L. A role for Melanin-Concentrating Hormone in learning and memory. Peptides 30, 2066-2070, doi:10.1016/j.peptides.2009.06.024 (2009).

9. Blouin, A. M. et al. Human hypocretin and melanin-concentrating hormone levels are linked to emotion and social interaction. Nature communications 4, 1547, doi:10.1038/ncomms2461 (2013).

10. Whiddon, B. B. & Palmiter, R. D. Ablation of neurons expressing melanin-concentrating hormone (MCH) in adult mice improves glucose tolerance independent of MCH signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 33, 2009-2016, doi:10.1523/JNEUROSCI.3921-12.2013 (2013).

11. Domingos, A. I. et al. Hypothalamic melanin concentrating hormone neurons communicate the nutrient value of sugar. Elife 2, e01462, doi:10.7554/eLife.01462 (2013).

12. Adams, A. C. et al. Ablation of the hypothalamic neuropeptide melanin concentrating hormone is associated with behavioral abnormalities that reflect impaired olfactory integration. Behavioural brain research 224, 195-200, doi:10.1016/j.bbr.2011.05.039 (2011).

13. Kosse, C. & Burdakov, D. Natural hypothalamic circuit dynamics underlying object memorization. Nature communications 10, 2505, doi:10.1038/s41467-019-10484-7 (2019).

14. Brailoiu, G. C. et al. Nesfatin-1: distribution and interaction with a G protein-coupled receptor in the rat brain. Endocrinology 148, 5088-5094, doi:10.1210/en.2007-0701 (2007).

15. Elias, C. F. et al. Characterization of CART neurons in the rat and human hypothalamus. The Journal of comparative neurology 432, 1-19, doi:10.1002/cne.1085 (2001).

16. Chee, M. J., Arrigoni, E. & Maratos-Flier, E. Melanin-concentrating hormone neurons release glutamate for feedforward inhibition of the lateral septum. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 35, 3644-3651, doi:10.1523/JNEUROSCI.4187-14.2015 (2015).

17. Risold, P. Y. & Swanson, L. W. Connections of the rat lateral septal complex. Brain research. Brain research reviews 24, 115-195, doi:10.1016/s0165-0173(97)00009-x (1997).

18. Swanson, L. W. & Cowan, W. M. The connections of the septal region in the rat. The Journal of comparative neurology 186, 621-655, doi:10.1002/cne.901860408 (1979).

19. Tingley, D. & Buzsaki, G. Transformation of a Spatial Map across the Hippocampal-Lateral Septal Circuit. Neuron 98, 1229-1242 e1225, doi:10.1016/j.neuron.2018.04.028 (2018).

20. Zhou, T. L., Tamura, R., Kuriwaki, J. & Ono, T. Comparison of medial and lateral septal neuron activity during performance of spatial tasks in rats. Hippocampus 9, 220-234, doi:10.1002/(SICI)1098-1063(1999)9:3<220::AID-HIPO3>3.0.CO;2-E (1999).

21. Gonzalez, J. A., Iordanidou, P., Strom, M., Adamantidis, A. & Burdakov, D. Awake dynamics and brain-wide direct inputs of hypothalamic MCH and orexin networks. Nature communications 7, 11395, doi:10.1038/ncomms11395 (2016).

22. Kong, D. et al. Glucose stimulation of hypothalamic MCH neurons involves K ATP channels, is modulated by UCP2, and regulates peripheral glucose homeostasis. Cell Metab. 12, 545–552 (2010)

23.Chee, M. J., Pissios, P. & Maratos-Flier, E. Neurochemical characterization ofneurons expressing melanin-concentrating hormone receptor 1 in the mousehypothalamus. J. Comp. Neurol. 521, 2208–2234 (2013).24. Kokkotou, E. G., Tritos, N. A., Mastaitis, J. W., Slieker, L. & Maratos-Flier, E.Melanin-concentrating hormone receptor is a target of leptin action in themouse brain. Endocrinology 142, 680–686 (2001)

Ranck, J. B. Jr. Studies on single neurons in dorsal hippocampal formationand septum in unrestrained rats. I. Behavioral correlates and firingrepertoires. Exp. Neurol. 41, 461–531 (1973).26. Kjelstrup, K. B. et al. Finite scale of spatial representation in the hippocampus. Science 321, 140–143 (2008). 

制版︱王思珍

本文完