​Nat Methods︱彭汉川课题组研发跨模态脑配准技术，为脑图谱构建和单细胞精度全脑映射研究提供重要支撑

撰文︱陈  鑫，刘力娟

责编︱王思珍

近年来，随着高分辨率生物显微成像[1-8]、组织透明[9-15]、稀疏标记[2,16-19]和神经元数字化重建技术[20-23]的发展，绘制哺乳动物单细胞分辨率全脑图谱成为可能。目前很多大型国际脑研究项目（如BRAIN Initiative Cell Census Network [24]、MouseLight project [21]、Allen Mouse Brain Connectivity Atlas [25]和Mouse Connectome project [26-28]）都致力于研究细胞分型、轴突长程投射绘制及微环路联接分析。通过不同高分辨率、高通量成像技术如连续双光子断层扫描（STPT）[2,4]、荧光显微光学切片断层成像技术（fMOST）[1]、光片荧光显微镜（LSFM）[7,8]、具有同步实时扫描和读出的体积成像（VISoR）[5,6]获得的图像数据集正以空前的速度大量产生。

如何有效地量化、比较这些来自不同样本、不同模态、不同时间甚至不同物种的数据，关键的一项技术是配准（registration）。将这些不同模态的脑图像和神经元重建数据映射/配准到一个公共坐标空间，不仅有助于后继神经元连接性、脑区投射、基因表达定量、脑结构和功能定量分析等神经生物学研究，而且对神经细胞类型鉴定、脑空间定位图谱和神经联接图谱构建等研究也至关重要。然而，不同标记方法、样本制备和成像方式导致数据在亮度、纹理和解剖结构上差异巨大，高精度跨模态脑配准仍然是领域内亟待解决的一个挑战。

2021年12月9日，东南大学脑科学与智能技术研究院的彭汉川教授团队，联合美国艾伦脑科学研究所、安徽大学等国内外多家单位，在Nature Methods上发表了题为“Cross-modal coherent registration of whole mouse brains”的研究论文。安徽大学教授/东南大学的兼职教授屈磊和安徽大学2019级博士研究生李园园为文章的共同第一作者，东南大学脑科学与智能技术研究院的彭汉川教授为文章的通讯作者。该研究提出了基于相干标记点映射（coherent landmark mapping，CLM）和深度神经网络（deep neural network，DNN）的图像配准框架，并构建了跨模态图像配准管线——mBrainAligner。基于mBrainAligner，研究团队构建了首个fMOST模态鼠脑图谱，完成了31个高分辨率fMOST脑图像及1741个小鼠全脑神经元形态重建数据到Allen公共坐标框架图谱（Common Coordinate Framework atlas，CCFv3）的映射，并首次在单细胞分辨率下完成了丘脑神经元投射的拓扑分析，为大规模全脑单细胞神经元形态分析和类型鉴定提供了重要支撑。

与使用STPT模态数据获得的CCFv3平均模板相比，不同模态的大脑图像在体素强度、图像纹理和大脑解剖结构方面常常差异巨大（图1 a）。针对这一挑战，研究团队提出了CLM图像配准框架。不同于现有“检测-匹配-筛选”策略，CLM采用“检测-映射/形变”策略建立图像间的密集对应关系，克服了跨模态配准中不可靠匹配点鉴定和筛选困难、标记点匹配易受局部极小干扰、有效匹配点数量难以控制以及脑图谱中脑区形状和相对位置先验利用率低等瓶颈问题。以CLM为基础，同时整合DNN来进一步提高CLM的配准精度和鲁棒性，研究团队构建了一套完整的跨模态配准管线——mBrainAligner。研究人员主要在mBrainAligner中开发了三个模块：（1）图像预处理和基于点集匹配的自动全局配准模块（图1 b）；（2）基于CLM的自动局部配准模块（图1 c）；（3）可选的半自动可视化修正模块（图1 d）。利用mBrainAligner，研究人员可将不同模态的3D小鼠全脑图像和神经元形态重建数据映射到CCFv3（图1 f）。此外，研究人员将CCFv3转换到“标准化”fMOST空间，生成了首个fMOST鼠脑模版图谱（图1 g）。

图1 mBrainAligner系统总体示意

（图源：Qu, L. et al., Nat Methods, 2021 ）

研究人员首先在6个感兴趣脑区的边界描绘方面评估了mBrainAligner的性能。这6个脑区分别是下丘脑（HY）、尾壳核（CP）、海马体（HPF）、大脑皮层（CTX）、小脑皮层（CBX）和脑干（BS）。通过将fMOST、LSFM、VISoR和MRI不同模态图像配准到CCFv3并叠加CCFv3中定义的脑区边界可直观评估mBrainAligner的配准质量（图2 a）。研究人员将31个高分辨率fMOST小鼠全脑图像配准到CCFv3，通过对比神经解剖专家的手工标注结果定量比较了mBrainAligner和其他配准管线的性能（图2 b）。

图2 mBrainAligner在脑区轮廓描绘中的准确性

（图源：Qu, L. et al., Nat Methods, 2021 ）

神经元胞体位置常被用作鉴定神经元类型的关键特征[29]。研究人员对31个fMOST小鼠全脑图像中的1708个神经元胞体进行了手动标注（图3 a），然后将这些胞体映射到CCFv3以计算的形式预测其所在脑区，并将计算预测结果与手动标注结果比较。结果表明，mBrainAligner映射胞体的平均精度高于其他方法（MIRACL、ClearMap、aMAP）且具有更小的胞体距离偏差（图3 b-g）。不同的丘脑区域被假设具有特定的皮层投射模式。研究人员将6个不同大脑中胞体位置在丘脑腹后内侧核（VPM）或腹后外侧核（VPL）的63个神经元映射到CCFv3，然后计算预测这些神经元的轴突投射位置，结果显示，这些轴突末端主要终止于皮层的第4层和第6层且投射模式清晰（图3 h）。此外，与其他方式相比，mBrainAligner显示了更高的预测精度（图3 i）。对于顶树突分布在皮层L1层的162个神经元图（图3 j），mBrainAligner的预测精度在90%以上。mBrainAligner在胞体定位和轴突投射预测方面的准确性高于MIRACL、ClearMap、aMAP。

图3 mBrainAligner在计算胞体定位和轴突投射预测中的准确性

（图源：Qu, L. et al., Nat Methods, 2021 ）

Allen CCFv3图谱越来越广泛地被用于小鼠大脑研究，其均值脑模板通过迭代平均STPT TissueCyte成像获得。研究人员采用类似的方式，使用mBrainAligner来构建小鼠大脑的fMOST域均值脑模板，并采用反映射CCFv3标注获取fMOST标注模板（图4 a, b）。fMOST图谱显示生物学和工程学的双重优势。第一，研究人员以定量的方式鉴定了两种模态的形态差异（图4 c），这有助于评估不同样本制备方法引起的变形（例如，不同的组织透明化方法）。第二，研究人员在两个图谱间建立了可重用且不变的转换（图4 b），从而可以有效地共享每种模态提供的大脑标注和重建结果。第三，研究人员降低了在两种模态间直接配准图像的技术难度（图4 d）。

mBrainAligner的鲁棒和准确的配准使得它能够通过少量的样本产生高质量的平均模板。在本研究中，研究人员使用了36个fMOST小鼠全脑图像，数量低于建立CCFv3图谱（1675个STPT小鼠全脑）和LSFM图谱（139个LSFM成像大脑）所用的鼠脑。通过逆映射CCFv3构建了首个fMOST模态鼠脑图谱（图4 b），确保了两个图谱对大脑解剖区域的一致定义，促进了跨模态信息共享。研究人员重新评估了mBrainAligner和其他方法将fMOST图像配准到fMOST图谱的性能，结果显示，mBrainAligner在脑区轮廓绘制、胞体定位准确度、映射胞体距离误差和轴突投射预测方面优于MIRACL、ClearMap、aMAP（图4 d）。

图4 小鼠大脑fMOST域图谱

（图源：Qu, L. et al., Nat Methods, 2021 ）

研究人员使用mBrainAligner进行细胞类型分析并在单细胞分辨率下研究神经元投射通路。以往的研究已在神经元群体水平上将丘脑神经元的拓扑结构描述出来[30]。在本研究中，研究人员使用mBrainAligner将通过BICCN联盟的共同努力[31]重建出来的神经元映射到CCFv3中。研究人员鉴定了1268个投射到主要皮质区的轴突树状簇，并研究了他们与胞体位置的关系，首次在单细胞分辨率下完成了丘脑神经元投射的拓扑分析（图5）。

图5 整合公共坐标框架配准大脑的丘脑神经元投射拓扑分析

（图源：Qu, L. et al., Nat Methods, 2021 ）

文章结论与讨论，启发与展望

该研究提出了基于CLM和DNN的图像配准框架，并构建了一整套含图像预处理、自动全局配准、自动局部配准和半自动配准的跨模态图像配准管线——mBrainAligner，以系统化应对模式生物跨模态配准挑战。基于mBrainAligner，研究团队完成了31个高分辨率fMOST脑图像及1741个小鼠全脑神经元形态重建数据到Allen CCFv3图谱的映射，构建了首个fMOST模态鼠脑图谱，给出了mBrainAligner在脑区划分、体细胞定位和轴突投射预测等任务中的应用示例，以具有生物学意义的度量指标验证了其在跨模态脑图像配准中的优越性，首次在单细胞分辨率下完成了丘脑神经元投射的拓扑分析。

mBrainAligner确保了研究者们能够从小样本集中构建一个高质量的基于fMOST的标准模板，而无需人工干预。通过mBrainAligner，研究者们能够将fMOST平均模板精确地配准到CCFv3，然后将CCFv3的标注逆映射到fMOST，保证了fMOST模态鼠脑图谱与Allen CCFv3之间标注的顺利转换和脑区的一致分割。mBrainAligner除了可用于小鼠全脑图像的内部配准、跨模态配准，还可用于配准局部成像的大脑。通过mBrainAligner产生的三维全脑神经元形态图谱，有效地帮助研究人员测试了多个组织层面上的神经元投射多样性的假说，为大规模全脑单细胞神经元形态分析和类型鉴定提供了重要支撑。此外，研究团队开源了mBrainAligner，以及一些有用的工具，包括2.5D角检测器、条纹伪影去除，以及图像或元数据映射工具，以促进跨学科和可重复的研究。目前的不足是mBrainAligner速度仍然较慢，单个脑配准大概需要6个小时。未来将更好地融合分割、配准和图谱构建三个任务，同时进一步提升计算速度和精度，持续为“中国脑计划”中多类模式生物脑图谱构建及相关神经生物学研究提供支撑。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-021-01334-w

（照片提供自：彭汉川和屈磊实验室 ）

安徽大学教授/东南大学兼职教授屈磊（左一）和安徽大学2019级博士研究生李园园为文章的共同第一作者（左二），东南大学脑科学与智能技术研究院彭汉川教授为文章的通讯作者。东南大学脑科学与智能技术研究院刘力娟副研究员（右二）和2019级硕士研究生熊烽（右一）为文章的共同作者。该研究由东南大学脑科学与智能技术研究院牵头，得到国家自然科学基金（61871411、32071367、U20A6005）、安徽省高校协同创新项目（GXXT-2019-008、GXXT-2021-001）的资助，同时得到东南大学SEU-ALLEN联合中心、计算智能与信号处理教育部重点实验室、信息材料与智能感知安徽省实验室、安徽大学超算中心、安徽大学国际脑科学中心和合肥综合性国家科学中心人工智能研究院的支持。

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制版︱王思珍

本文完