Neuron︱李毓龙实验室开发新型荧光探针用于检测胞外ATP的时空动态变化

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王思珍

撰文︱武照伐

责编︱王思珍

三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、腺苷（Adenosine，Ado）等嘌呤类分子细胞内外广泛存在。胞内的嘌呤类分子主要负责调控细胞能量代谢等过程；而胞外的嘌呤类分子则作为信号分子（被称为“嘌呤类递质”），通过作用在其相应受体调节呼吸调控、味觉感受、睡眠等生理活动；嘌呤类递质及其受体还参与调节癫痫、疼痛、炎症反应、脑外伤和缺血等病理状态[1,2]。此外，嘌呤能信号失调还与抑郁、精神分裂症等精神类疾病密切相关。然而，迄今为止，解密嘌呤能信号传递功能的一大技术瓶颈是缺乏灵敏、特异且非侵入性的工具，因此未能以高时空分辨率地报告嘌呤类递质的动态变化[3,4]。

2021年12月22日，北京大学的李毓龙实验室在Neuron杂志在线发表了题为“A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo”的研究论文，报道了新型基因编码的ATP探针GRAB_ATP1.0的开发和在体外及活体动物的应用。李毓龙实验室自2018年以来，先后开发了针对乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、腺苷、五羟色胺、内源大麻素等神经递质或调质的荧光探针，此次发表的GRAB_ATP1.0是其又一力作，进一步扩展了GRAB系列荧光探针家族（拓展阅读：李毓龙课题组最新研究进展，详见“逻辑神经科学”报道：Nat Biotechnol| 李毓龙实验室开发新型荧光探针用于检测内源大麻素的时空动态变化）。

在这一工作中，李毓龙实验室运用GRAB探针策略（GPCR Activation-Based sensor），基于人源ATP受体P2Y1和循环重排的绿色荧光蛋白cpEGFP开发了ATP探针GRAB_ATP1.0（简称为ATP1.0）。在体外培养的HEK293T细胞、原代神经元及星形胶质细胞中，ATP1.0探针均表现出优异的细胞膜定位。神经元表达的ATP1.0对外源加入的ATP和ADP有约780%的信号响应、约80 nM的亲和力（EC₅₀）、以及高度的分子特异性（图1）。此外，ATP1.0能够在亚秒级别响应胞外ATP浓度的变化。

图1 ATP1.0在HEK293T细胞和原代神经元上的表现

（图源：Wu Z et al., Neuron, 2021）

那么，ATP1.0探针能否用来检测内源释放的ATP呢？作者从原代培养的海马细胞入手，发现ATP1.0能够检测到机械刺激及低渗透压刺激引发的ATP释放，药理学实验及突变型探针实验进一步验证了ATP1.0检测信号的特异性（图2）。有意思的是，在不给予额外刺激时，ATP1.0也能灵敏地记录到直径约为30微米的自发性的ATP释放事件，表明ATP的释放具有化学分子特异和空间特异性。

图2 ATP1.0在原代培养的海马细胞中检测内源ATP的释放

（图源：Wu Z et al., Neuron, 2021）

ATP1.0探针能否在活体动物加以运用呢？过去的研究发现，当细胞受到损伤时，胞内毫摩尔级别的ATP被释放胞外，作为“危险信号”被周围的胶质细胞所感知，从而激活小胶质细胞、释放趋化因子等，产生免疫反应；胶质细胞上表达的嘌呤类受体在小胶质细胞激活、迁移及分泌信号因子过程中发挥重要作用[5-7]。那么，在这一过程中，信号分子ATP的传播和小胶质细胞的迁移是如何动态并变化的呢？作者将ATP1.0探针表达在斑马鱼中，通过激光照射引发局部损伤时发现ATP的释放呈现“波状”传播；通过将绿色ATP1.0探针表达在红色荧光蛋白标记小胶质细胞的转基因斑马鱼中，能够直观地检测到随着ATP信号的传播小胶质细胞的迁移过程（图3上）。

图3 ATP1.0报告斑马鱼受到局部损伤时及小鼠发生免疫反应时大脑中的胞外ATP信号

（图源：Wu Z et al., Neuron, 2021）

当大脑处于疾病状态时，ATP的释放又会呈现什么样的变化？如上所述，嘌呤能信号在免疫中扮演着重要角色[8]。为了检测免疫反应过程中大脑中ATP信号的变化，作者通过腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的方式引发小鼠的系统性免疫反应，同时通过AAV病毒介导的方法将ATP1.0表达在小鼠的大脑皮层，并借助双光子成像记录ATP的信号（图3下）。有意思的是，LPS注射后，小鼠大脑皮层呈现出强烈、但空间特异的ATP信号上升现象（见视频）。

视频：腹腔注射LPS的小鼠炎症模型中大脑皮层ATP信号的变化，ATP1.0能够观察到局部ATP释放的信号

（视频来源：Wu Z et al., Neuron, 2021）

除了开发高灵敏的ATP1.0探针外，作者还开发了反应动力学更快及亲和力更低的ATP探针ATP1.0-L。在神经元中表达的ATP1.0-L对胞外的ATP的亲和力（EC₅₀）约为32 μM。当在原代培养的海马细胞及活体的斑马鱼中表达，ATP1.0-L均能检测到更加局部的ATP信号。

图4 文章总结图：新型ATP1.0探针灵敏、高时空分辨率地报告胞外ATP的动态变化

（图源：Wu Z et al., Neuron, 2021）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，在这项工作中作者开发了新型遗传编码的ATP荧光探针，实现了对胞外ATP动态变化的高时空分辨率的记录（图4）。在此之前，李毓龙课题组在2020年还开发了另外一种嘌呤类递质腺苷的GRAB荧光探针，并助力中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心徐敏团队在睡眠调控中的研究[9]。

嘌呤类递质受体在全身广泛表达，这项工作验证了新型ATP探针在研究大脑损伤及免疫调控中的应用；由于ATP1.0探针是基因编码的，结合病毒侵染及转基因动物模型，ATP1.0有望应用于更多的组织和场景。相信新型工具的开发，将助力科学家更加深入地研究嘌呤能信号传递在生理和病理条件下的动态变化及转换，从而了解它们的功能和调控机理。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2021.11.027

北京大学生命科学学院博士后武照伐为本文第一作者，李毓龙教授和武照伐博士为共同通讯作者，本科毕业生何凯凯、博士研究生潘孙磊、李柏翰、邓飞和王欢等对文章做出了重要贡献。该工作得到了北京脑科学与类脑研究中心井淼团队（陈阅、席凤雪）及中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杜久林团队（李红羽、刘亭亭）等的通力合作，并得到了北京大学膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、国家自然科学基金、北京市科委、峰基金及勃林格殷格翰博士后奖学金等机构和经费的大力支持。

第一作者并通讯作者武照伐博士（左），通讯作者李毓龙教授（右）

（照片提供自李毓龙实验室）

实验室介绍

李毓龙

北京大学生命科学学院教授

北京大学麦戈文脑科学研究所PI

北大-清华生命科学联合中心PI

研究领域：

人的大脑由数十亿的神经元组成，后者又通过数万亿的突触组成复杂的神经网络。不同种类的神经元经过或远或近的投射，通过突触与其他神经元进行信息交流，实现感知觉、决策和运动等高级神经功能。

研究大脑的最大挑战在于脑的高度复杂性。我们实验室集中在神经元通讯的基本结构突触上，从两个层面上开展研究：一是开发前沿的工具，即开发新型成像探针，用于在时间和空间尺度上解析神经系统的复杂功能；二是借助先进的工具探究突触传递的调节机制，特别是在生理及病理条件下对神经递质释放的调节。

具体而言，对于工具开发，我们集中于：

1、结合光遗传学和荧光成像，无损伤性的研究神经元之间的电突触连接。电突触的异常可导致耳聋、癫痫、脑部肿瘤和心脏功能异常等疾病。

2、开发可遗传编码的检测神经递质/调质的荧光探针。神经递质/调质是神经元化学突触传递的关键介导分子，与感知、学习和记忆以及情绪密切相关。

利用上述荧光探针，我们的功能性和生理性的研究集中于：

1、结合生物信息学、分析化学、生物化学、生理学和成像学方法，系统地探索和鉴定潜在的新型小分子神经递质。

2、研究神经元中重要的分泌性囊泡“高密度核心囊泡”的蛋白质组学，分析囊泡内的神经肽组成。这些神经肽对于调节食物摄取、侵犯性行为和生物节律有重要的调节作用。

3、寻找上述新型化学递质/调质小分子的对应受体，即寻找“孤儿”受体的配体。

4、结合双光子成像和可遗传编码的荧光探针，使用果蝇和小鼠作为模式生物，研究嗅觉传导或睡眠过程中脑的工作机制。 

更多李毓龙实验室工作详见：http://yulonglilab.org/；此外，李毓龙实验室诚聘不同学科背景的副研究员、博士后以及科研助理，待遇从优，欢迎对脑科学感兴趣的有志青年加入。

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参考文献（上下滑动查看）  

1.Fields, R.D., and Burnstock, G. (2006). Purinergic signalling in neuron-glia interactions. Nat Rev Neurosci 7, 423-436.

2.Burnstock, G. (2008). Purinergic signalling and disorders of the central nervous system. Nat Rev Drug Discov 7, 575-590.

3.Dale, N. (2021). Biological insights from the direct measurement of purine release. Biochem Pharmacol, 114416.

4.Wu, Z., and Li, Y. (2020). New frontiers in probing the dynamics of purinergic transmitters in vivo. Neurosci Res 152, 35-43.

5.Gourine, A.V., Llaudet, E., Dale, N., and Spyer, K.M. (2005). ATP is a mediator of chemosensory transduction in the central nervous system. Nature 436, 108-111.

6.Wang, X., Arcuino, G., Takano, T., Lin, J., Peng, W.G., Wan, P., Li, P., Xu, Q., Liu, Q.S., Goldman, S.A., et al. (2004). P2X7 receptor inhibition improves recovery after spinal cord injury. Nat Med 10, 821-827.

7.Li, Y., Du, X.F., Liu, C.S., Wen, Z.L., and Du, J.L. (2012b). Reciprocal Regulation between Resting Microglial Dynamics and Neuronal Activity In Vivo. Developmental Cell 23, 1189-1202.

8.Idzko, M., Ferrari, D., and Eltzschig, H.K. (2014). Nucleotide signalling during inflammation. Nature 509, 310-317.

9.Peng, W., Wu, Z., Song, K., Zhang, S., Li, Y., and Xu, M. (2020). Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons. Science 369.

制版︱王思珍

本文完