Nat Commun︱星形胶质细胞抑制非人灵长类脑缺血损伤中外周巨噬细胞的浸润

撰文︱Sunny

责编︱王思珍

众所周知，星形胶质细胞（astrocyte）在缺血性中风（ischemic stroke）等脑损伤的发病机制中起着至关重要的作用[1]。由于损伤等外源性刺激，星形胶质细胞被激活成为反应性星形胶质细胞，同时它们的基因表达、形态和功能也发生剧烈变化。虽然有研究表明，反应性星形胶质细胞的形成会加剧继发性损伤，导致神经元的退化。但也有研究强调，反应性星形胶质细胞呈现高度异质性，也可以在中枢神经系统病理反应中为幸存的神经元提供关键的神经保护作用[2]。

近年来，越来越多的研究显示，在啮齿类动物中得到的实验结果并不能在人类的临床实验中复制[3]。啮齿类与非人灵长类的进化差异可能是导致该现象的主要原因。最近，一项对非人灵长类动物和小鼠的神经元转录组分析的研究显示，非人灵长类动物中基因的表达模式更加细化，即使在同一类型神经元中，mRNA的表达也会呈现空间特异性[4]；通过转录组分析，该项研究还在非人灵长类动物大脑中发现了一种在小鼠中不存在的中间神经元亚型[4]。这些结果说明非人灵长类动物的大脑的基因表达与啮齿类动物相比具有进化上的特异性。因此，对非人灵长类动物大脑转录组的进一步研究对于寻找人类大脑疾病的机理以及治疗靶点具有重要作用。

近日，来自澳大利亚莫纳什大学再生医学研究所的Anthony G. Boghdadi（第一作者）、James A. Bourne（通讯作者）等人在Nature Communications上发表了题为“NogoA-expressing astrocytes limit peripheral macrophage infiltration after ischemic brain injury in primates”的最新研究论文。该论文利用单核转录组分析来表征绒猴视觉皮质缺血性中风后的星形胶质细胞。发现狨猴脑中风后的星形胶质细胞高表达RTN4A/NogoA基因，而该基因的上调在小鼠脑中风的星型胶质细胞中却不明显。进一步研究发现RTN4A基因可介导星形胶质细胞的抗炎反应，并可能有助于限制脑中风损伤过程中外周巨噬细胞的浸润。

首先，作者通过将内皮素-1（ET-1）注射到狨猴的单侧视觉皮层，构建了狨猴的脑缺血中风损伤模型（图1 a）。七天后收集脑损伤区域以及相同的对侧对照区域的皮层组织，进行单核转录组测序。之后对测序后的每个细胞核的数据进行细胞类型聚类分析，并利用UMAP（uniform manifold approximation and projection）方法进行数据降维和可视化后发现，对照组与损伤组呈现出不同的基因表达模式（图1 b）。作者根据已知的细胞类型特异性标记基因的表达模式 来进行总体的细胞类型聚类分析（图1 c）。之后作者重点关注了星形胶质细胞的基因表达变化。结果显示，脑中风损伤后星形胶质细胞的转录组发生非常大的变化，损伤组和对照组之间几乎完全分离（图1 d），并且损伤组的星形胶质细胞标记基因的表达明显升高（图1 e）。之后作者共鉴定出了576个差异表达基因，其中上调基因明显多于下调基因，在上调最明显的30个基因，基因RTN4A (NogoA)发生显著上调（图1 f），RTN4A是一种少突胶质细胞标记物并已知可以抑制神经突的生长[5]。

图1绒猴脑缺血性中风后反应性星形胶质细胞的转录组变化及分类

（图源：Boghdadi AG, et al., Nat Commun. 2021）

之后，作者根据RTN4A的表达对星形胶质细胞进行分类，发现RTN4A差异表达的星形胶质细胞也表达了252个其他损伤依赖的差异表达基因（图1 g）。 对RTN4A^-和RTN4A⁺星形胶质细胞进行了GO分析后发现，RTN4A^-星形胶质细胞可能对突触可塑性和离子转运具有正向调节作用，而RTN4A⁺星形胶质细胞则可能对白细胞和胞吐反应具有负向调节作用（图1 h）。 之后，作者利用功能模块检测进一步分析了RTN4A^-以及RTN4A⁺星形胶质细胞的前100个差异表达基因的相关功能模块。结果显示了相关的四个功能模块中有三个发生了重叠，但在适应性免疫反应的调节、白细胞转运和血脑屏障完整性这个功能模块中具有显著差异（图1 i, j）。这些结果表明RTN4A在星形胶质细胞中的功能可能与这个功能模块相关。

然后，作者选择了三个已知的在脑中风损伤后高表达的星形胶质细胞标记基因GAP43、CD44、KLF6对转录组数据进行验证。首先证明了脑中风后RTN4高表达的星型胶质细胞也会高表达GAP43、CD44、KLF6基因（图2 a）。然后通过免疫组织化学染色方法也发现脑中风损伤后，星形胶质细胞中NogoA的表达水平升高，并且与GAP43、KLF6以及CD44的共定位显著增加（图2 b-d）。

图2 在狨猴组织中利用脑中风标记基因验证转录组中NogoA的表达上调现象

（图源：Boghdadi AG, et al., Nat Commun. 2021）

因为NagoA在脑中风损伤后表达升高的现象在小鼠中并没有被文献报道过。因此作者利用免疫染色的方法分别研究了小鼠和狨猴在脑中风后的NagoA表达变化。结果显示，在小鼠皮层中，只在邻近损伤核心部位的的星形胶质细胞中有不到50%的NogoA的表达（图3 a, c）。而在狨猴中，NogoA几乎在损伤周围的所有星形胶质细胞中表达（图3 b, c）。此外，与绒猴相比，小鼠星形胶质细胞中NogoA免疫反应的荧光强度几乎没有（图3 d）。这些数据表明小鼠和绒猴反应性星形胶质细胞上的NogoA的表达存在显著差异，其在脑中风后的表达上调可能是灵长类动物特有的。为了确定在绒猴中观察到的现象是否也在人类中存在，作者获取了缺血性中风后一周的人类皮质组织，并进行了NogoA免疫染色。结果发现，在人类脑中风部位周围的GFAP⁺反应性星形胶质细胞中NogoA同样具有高表达。

图3 小鼠、绒猴和人类缺血性中风后NogoA的表达

（图源：Boghdadi AG, et al., Nat Commun 2021）

LILRB2是NogoA的一种免疫受体，并且主要表达于外周单核巨噬细胞、B细胞中[6]。而且在缺血脑损伤后，血脑屏障被破坏，促使外周的巨噬细胞浸润到脑组织实质中[7]。而在这个过程中，反应性星形胶质细胞对炎症细胞的浸润发挥抑制作用[8]。因此，作者推测，脑中风后NogoA在反应性星形胶质细胞中的高表达能够帮助其抵御巨噬细胞浸润。为了验证这个推测，作者首先研究了缺血性脑损伤后巨噬细胞浸润情况，检测到在脑损伤区几乎所有的巨噬细胞都来自外周，表现为巨噬细胞标记蛋白Iba1的高表达以及小胶质细胞特异性标记蛋白TMEM119的低表达（图4 a, c）。巨噬细胞的浸润在脑中风损伤后7天达到峰值，之后逐渐减少（图4 b, c）。此外，他们也在体外培养的人类以及狨猴的巨噬细胞中检测到了LILRB2的表达（图4 d）。在脑中风狨猴脑组织中也观察到了浸润的巨噬细胞与LILRB2蛋白的共定位（图4 e）。通过免疫荧光染色，作者还发现高表达LILRB2的巨噬细胞与高表达NogoA的反应性星形胶质细胞在脑损伤部位的空间分布是并列的（图4 f）。这些结果说明，在脑中风损伤后，配体NogoA-受体LILRB2之间的相互作用促使了星形胶质细胞包围浸润的巨噬细胞。

图4 绒猴缺血性脑中风后外周血巨噬细胞的浸润

（图源：Boghdadi AG, et al., Nat Commun. 2021）

接下来，作者利用体外培养的人类单核细胞系THP-1研究了NogoA对THP-1来源的巨噬细胞的作用。转录组数据显示LILRB2在THP-1细胞系中具有高表达[9]（图5 a），之后通过蛋白免疫印迹（western blotting）和免疫染色实验发现，NogoA受体LILRB2在THP-1来源的巨噬细胞中高表达，其他受体比如NgR1和S1PR2表达相对微弱（图5 b, c）。随后作者检测LILRB2蛋白关键的下游效应物：POSH、Shroom3、RhoA和ROCK1来研究NogoA能否激活巨噬细胞的LILRB2信号通路。作者通过加入NogoA的两个有效功能域Nogo-66和Nogo-Δ20（图5 d）来模拟NogoA的激活。结果显示，Nogo-66和Nogo-Δ20都能诱导巨噬细胞LILRB2及其下游效应物的表达升高（图5 e-h）。

最后，作者通过条纹实验检测了人THP-1巨噬细胞中NogoA/ LILRB2信号通路的功能作用。条纹实验（stripe assay），即吸引-排斥实验（attraction/repulsion assay），简言之，在具有一定尺寸凹槽的盖玻片上，先孵育NogoA抗体、或NogoA抗体与LILRB2阻断剂，然后将孵育好的玻片置于孔板（plate）底部，再与THP-1巨噬细胞共培养，随后观察细胞的吸引-排斥情况。结果显示，相比较于对照组（Fc），只有NogoA抗体（Nogo-66-Fc或Nogo-Δ20-Fc）时，条纹间（即凹槽）Iba1⁺巨噬细胞数量显著增加，NogoA抗体与LILRB2阻断剂同时存在时，条纹中的巨噬细胞相对减少（图5 i, j），说明NogoA/LILRB2信号通路可引起对巨噬细胞的排斥反应。

图5 NogoA/ LILRB2信号诱导人源巨噬细胞的排斥反应

（图源：Boghdadi AG, et al., Nat Commun 2021）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该文比较了非人灵长类动物脑缺血中风后损伤区域的星形胶质细胞的转录组变化，发现中风后大脑中参与免疫调节信号通路的基因明显上调，并且筛选了一系列差异表达基因。在这些基因中，作者发现RTN4A（NogoA）的表达显著上调，而这一现象在小鼠中并没有发现。进而作者证明了NogoA能与表达其受体LILRB2的巨噬细胞相互作用，并能排斥巨噬细胞。这些结果说明灵长类动物脑缺血中风后反应性星形胶质细胞可能通过表达NogoA阻止周围巨噬细胞的浸润。

不过研究也存在局限性。首先，转录组数据的采集仅限于绒猴缺血性脑损伤后的1周，或许不同时间点的星形胶质细胞转录组分析可以提供更全面的基因表达变化。其次，该研究的分析仅限于病灶近端区域，研究损伤部位远端区域星形胶质细胞的转录组学和表型变化将提供更完整的星形胶质细胞反应的空间图景。第三，该研究的功能分析都集中在一个基因上，鉴于星形胶质细胞中有大量差异表达的免疫调节基因，灵长类动物脑中风损伤后可能也存在其他基因影响反应性星形胶质细胞功能。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-021-27245-0

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1. Liddelow, S. A. & Sofroniew, M. V. Astrocytes usurp neurons as a disease focus. Nat. Neurosci. 22, 512–513 (2019).

2. Liddelow, S. A. & Barres, B. A. Reactive astrocytes: production, function, and therapeutic potential. Immunity 46, 957–967 (2017).

3. O’collins, V. E. et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Ann. Neurol. 59, 467–477 (2006).

4. Krienen, F. M. et al. Innovations present in the primate interneuron repertoire. Nature 586, 262–269 (2020).

5. Chen, M. S. et al. Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1. Nature 403, 434–439 (2000).

6. Brown, D., Trowsdale, J. & Allen, R. The LILR family: modulators of innate and adaptive immune pathways in health and disease. Tissue Antigens 64, 215–225 (2004).

7. Vogel, D. Y. et al. Macrophages migrate in an activation-dependent manner to chemokines involved in neuroinflammation. J. Neuroinflammation 11, 23 (2014).

8. Wanner, I. B. et al. Glial scar borders are formed by newly proliferated, elongated astrocytes that interact to corral inflammatory and fibrotic cells via STAT3-dependent mechanisms after spinal cord injury. J. Neurosci. 33, 12870–12886 (2013).

9. Gosselin, D. et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science 356, eaal3222 (2017). 

制版︱王思珍

本文完