EMBO Rep｜康九红课题组发现lncRNA SOX1-OT调控人ESC神经元发生的新机制

重 要 说 明

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王思珍

撰文︱康九红

责编︱王思珍

长链非编码RNA（lncRNA）是长度大于200nt且不编码蛋白的RNA分子，研究显示lncRNA能够通过调控基因转录、作为信号分子、蛋白质复合物支架、分子诱饵等方式实现其生物学功能，并参与调控多种生物学过程[1]。lncRNAs广泛存在于神经系统中[2]，近年来的一些研究揭示了部分lncRNA在神经系统中的调控作用。然而，仍有相当数量的神经系统中高表达的lncRNAs，其功能尚不明确。

人胚胎干细胞（ESC）具有分化成包括神经在内的多种组织细胞的能力，并且其分化过程在相当程度上与体内发育相类似，是体外研究人类发育过程和模拟疾病发生的良好模型[3]。近来发展的利用人PSC的3D培养方法建立脑部类器官—“类脑体”则能分化产生规则排列的神经前体细胞和放射状胶质细胞，并能够形成类似脑室的空泡，其进一步接近于大脑本身的构造，具有与体内极其类似的神经发育过程，是利用干细胞研究脑发育等非常好的系统[4]。

SOXB1家族转录因子，主要包括SOX1、SOX2和SOX3，在神经系统发育过程中起到重要的调控作用。研究显示，SOXB1家族在神经前体细胞中高表达，在小鼠胚胎瘤细胞中过表达SOX1能够起始细胞向神经方向分化[5]；在端脑来源的神经前体细胞中过表达SOX1能够明显促进向TUBB3阳性神经元的分化[6]。然而，在神经分化过程中，SOX1如何调控神经元分化以及SOX1的表达受到哪些分子调控，尚不明确。

2021年12月20日，同济大学的康九红团队在EMBO Reports杂志上发表了题为“LncRNA SOX1-OT V1 acts as a decoy of HDAC10 to promote SOX1-dependent hESC neuronal differentiation”的研究论文，研究了一条跨越SOX1的lncRNA SOX1-OT在人ES神经元发生过程中调控作用及其机制。奚佳捷副教授、徐焱鑫博士和郭贞明博士为本文的共同第一作者，康九红教授为本文的通讯作者。

该研究首先构建了人ESC神经分化系统。发现随着神经分化的起始，早期神经分化相关转录因子，诸如PAX6、SOX1表达上升，继而在分化第23天，这些细胞表达大脑皮层相关转录因子TBR1/TBR2；而在神经分化的第10天加入腹侧化因子SAG可将ESC往内侧神经节隆起（MGE）方向分化，PAX6随着腹侧分化的进行表达下降，腹侧化Nkx2.1和Nkx2.2表达上升。SOX1-OT是一个跨越转录因子SOX1的lncRNA，在皮层分化和MGE分化过程中皆上调表达。接着，通过在SOX1-OT转录起始位置插入连续3个PolyA转录终止信号，我们建立了抑制SOX1-OT表达的人ES细胞系（SOX1-OT-PAKI），并且诱导该细胞分别向大脑皮层和MGE方向分化。发现，在神经分化起始阶段，抑制SOX1-OT并不会影响早期神经转录因子PAX6的表达。继而在向皮层分化过程中，抑制SOX1-OT引起SOX1阳性细胞数量都会减少，虽不影响TBR2阳性细胞的数量，但TUBB3阳性皮层神经元的数目明显减少。在腹侧MGE分化中，抑制SOX1-OT同样会导致SOX1阳性细胞数量都会减少，虽不影响NKX2.1阳性细胞的分化产生，但NKX2.1阳性细胞却不能进一步分化成为GABA阳性神经元。这些结果表明抑制SOX1-OT虽然不影响hESC向神经上皮细胞和区域化的神经祖细胞分化，但会显著地抑制神经元的形成（图1）。

图1 抑制SOX1-OT显著地抑制神经元的形成

（图源：Xi, et al., EMBO Rep, 2021）

为了研究SOX1-OT调控SOX1的机制，作者观察了抑制SOX1-OT对于SOX1基因组区域组蛋白修饰的变化。ChIP结果显示抑制SOX1-OT不影响SOX1基因组区域H3K4me3和H3K27me3的水平，但会显著下调H3K14和H3K27的乙酰化水平。HDAC是重要的去乙酰化酶，作者尝试HDAC的抑制剂是否能够挽救抑制SOX1-OT所导致的神经元分化缺陷。在SOX1-OT-PAKI分化8-16天，HDAC抑制剂24781也有类似的效果，能够显著增加SOX1阳性细胞（16天）、SOX1基因组区域的H3K14和H3K27乙酰化水平（16天）和神经元的数目（32天），显示SOX1-OT可能通过调节组蛋白乙酰化修饰导致神经元分化缺陷。由于24781是一个广谱的HDAC抑制剂，其可以抑制HDAC1、2、3、6、8、10而发挥作用，因此作者进一步检测了在SOX1-OT抑制细胞系中，抑制哪一个HDAC能够挽回SOX1的表达下调以及神经元的分化缺陷。作者利用一个HDAC的抑制剂组合，包括了2833（抑制HDAC1、3）、CAY（抑制HDAC2）、34051（抑制HDAC8）和BUF（抑制HDAC6、10），发现在分化8-16天加入抑制剂组合能够显著上升SOX1阳性细胞的数量。进而作者发现在抑制剂组合中撤走BUF不能挽救因抑制SOX1-OT而导致的SOX1阳性细胞数减少，而撤走其他抑制剂则没有影响。同时发现，在分化8-16天仅加入BUF，即能够挽回抑制SOX1-OT所导致的SOX1的表达下调、SOX1基因组区域的H3K14和H3K27乙酰化水平降低，以及相关神经元分化缺陷。在腹侧分化中也得到了相类似的结果。这些结果表明HDAC6和10参与了SOX1-OT对于神经分化调控（图2）。

图2 SOX1-OT调控SOX1基因组区域H3K14和H3K27的乙酰化水平

（图源：Xi, et al., EMBO Rep, 2021）

在此基础上，作者进行了RNA pulldown实验，结果显示SOX1-OT能够与HDAC10结合而不与HDAC6结合，ChIP实验也显示在抑制SOX1-OT后，HDAC10在SOX1区域结合上升，提示SOX1-OT通过与HDAC10结合调控了SOX1基因区域的乙酰化修饰和SOX1的表达。进一步的RNA pulldown实验显示SOX1-OT的5’端能够与HDAC10结合，而其3’端则不能。在皮层分化还是在MGE分化中，过表达全长SOX1-OT和SOX1-OT 5’端皆能回复SOX1阳性细胞的数量，而过表达SOX1-OT 3’端则不能。同样，过表达全长SOX1-OT和SOX1-OT 5’端皆能恢复SOX1基因区域的H3K14和H3K27的乙酰化水平，而过表达SOX1-OT 3’端则不能。并且过表达全长SOX1-OT和SOX1-OT 5’端皆能阻止HDAC10在SOX1基因区域的结合，而过表达SOX1-OT 3’端则不能。这些结果进一步确证了SOX1-OT和HDAC10之间的相互作用，以及这种相互作用在阻止HDAC10与SOX1基因区域结合进而调节神经分化中的关键作用（图3）。

图3 SOX1-OT 5’端与HDAC10结合阻止HDAC10在SOX1基因组区域结合

（图源：Xi, et al., EMBO Rep, 2021）

原神经基因（proneural gene）ASCL1、NGN1和NGN2等在神经元发生中具有关键的作用。为了探究SOX1-OT和SOX1调节神经分化的下游靶分子，作者检测了这些原神经基因的表达。实验发现，在抑制SOX1-OT后，ASCL1的表达显著下调，而NGN1和NGN2的表达没有变化。进一步研究发现，神经分化过程中在SOX1-OT PAKI中过表达SOX1能够激活ASCL1的表达。并且不论在皮层分化，还是在MEG分化中，SOX1皆能结合到ASCL1的启动子区域。接着作者在SOX1-OT PAKI细胞系中建立了可诱导表达ASCL1的细胞系SOX1-OT PAKI ptASCL1，并分别往皮层和MGE分化。结果显示，无论是在皮层分化，还是在MGE分化中，过表达ASCL1皆能够挽救因抑制SOX1-OT所导致的神经元分化缺陷。进一步证实了ASCL1是SOX1-OT/SOX1介导神经分化的重要靶分子（图4）。

图4 ASCL1介导了SOX1-OT/SOX1调控神经元的分化

（图源：Xi,et al., EMBO Rep, 2021）

图5 SOX1-OT作用模式图

（图源：Xi, et al., EMBO Rep, 2021）

文章结论与讨论，启发与展望

神经元是神经系统最基本的结构和功能单位。在神经发育过程中，神经上皮细胞受到外界因子的诱导形成区域化的神经前体细胞，并进而通过神经发生产生有功能的神经元。胚胎干细胞的神经分化可在体外模拟这一过程。基于干细胞神经分化系统，本研究发现无论是在背侧皮层分化，还是在腹侧MGE分化中，抑制SOX1-OT既不影响人ESC分化成为神经上皮细胞，也不影响其分化成为特定区域的神经祖细胞，但却不能进一步分化成为神经元，显示其表达对于神经元发生是至关重要的。本研究发现SOX1-OT能够通过其5’端与HDAC10结合，缺失SOX1-OT后，HDAC10在SOX1基因组区域结合增加而导致SOX1基因组区域乙酰化水平的降低，显示SOX1-OT作为HDAC10的decoy，充当了内源HDAC10的抑制剂而维持了SOX1的表达，进而促进了神经元的分化。作为SoxB1家族中的一员，SOX1在神经细胞的命运决定和神经元的分化中发挥重要的作用。本研究研究表明，过表达SOX1能够促进ASCL1的表达，且SOX1能够直接结合到ASCL1的启动子区，表明SOX1是通过直接激活ASCL1而促进神经元的分化。该研究主要着眼于SOX1-OT的调控作用，而在神经分化过程，调控SOX1-OT表达的上游分子机制尚有待于进一步的研究。综上所述，该研究将有助于我们更好的理解长链非编码RNA如何与表观修饰分子共同调控下游基因的表达，并进一步揭示人脑神经元分化过程中的调控机制（图5）。

原文链接：https://www.embopress.org/doi/epdf/10.15252/embr.202153015

该工作得到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金委、上海市科委等项目的支持。

通讯作者康九红教授

（照片提供自康九红实验室）

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[1] Wang KC, Chang HY (2011) Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Molecular cell 43: 904-914

[2] Qureshi IA, Mehler MF (2012) Emerging roles of non-coding RNAs in brain evolution, development, plasticity and disease. Nature reviews Neuroscience 13: 528-541

[3] Zhang SC (2006) Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain pathology 16: 132-142

[4] Lancaster MA, Renner M, Martin CA, Wenzel D, Bicknell LS, Hurles ME, Homfray T, Penninger JM, Jackson AP, Knoblich JA (2013) Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501: 373-379

[5] Pevny LH, Sockanathan S, Placzek M, Lovell-Badge R (1998) A role for SOX1 in neural determination. Development 125: 1967-1978

[6] Kan L, Israsena N, Zhang Z, Hu M, Zhao LR, Jalali A, Sahni V, Kessler JA (2004) Sox1 acts through multiple independent pathways to promote neurogenesis. Developmental biology 269: 580-594

制版︱王思珍

本文完