Sci Transl Med︱单胺能抗抑郁药物起效迟缓的新证据：海马cAMP调节HCN通道功能进而影响小鼠行为和记忆
撰文︱郑媛嘉
责编︱王思珍
重度抑郁症（major depressive disorder，MDD）是目前导致残疾的主要原因之一[1]，认知功能障碍也是显著相关的部分原因[2]。尽管目前许多MDD病人对抗抑郁药有耐药性，但目前主流的治疗——单胺能抗抑郁药物（monoaminergic antidepressants），比如5-羟色胺再摄取抑制剂等——仍可以在某些条件下能够有效缓解MDD患者的认知障碍[3]。然而单胺能抗抑郁药物起效需要数周，目前对于起效迟的相关机制还不清楚。
海马背侧的超极化激活的环核苷酸门控通道（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide–gated（HCN）channels）已被确定为MDD的潜在治疗靶点，并在调节认知方面发挥作用。这些电压门控通道受到细胞内环核苷酸（cAMP）的调控，并影响时间累积效应和细胞兴奋性[4, 6, 7]。敲除或敲低背侧CA1锥体神经元中的HCN通道，会出现“抗抑郁药样”行为（antidepressant-like behavior）或“动机性”行为（motivated behavior）[11, 12]，提示了拮抗这些通道可能是治疗MDD的有效策略。基底前脑HCN通道的敲除与空间记忆性能的改善也有关[6]，但在慢性应激的动物模型中，海马背侧HCN通道的表达增多[13]，表明这些通道可能也参与了应激相关认知变化的病理生理过程。
HCN通道主要包括HCN1、HCN2、HCN3、HCN4，分别由由基因Hcn1、Hcn2、Hcn3、Hcn4所编码。海马区主要表达HCN1和HCN2（本文统称“HCN通道”）[14]。在海马CA1锥体神经元中，HCN通道在顶端树突远端腔隙分子层（stratum lacunosum moleculare）的表达比近端放射层（stratum radiatum）多，HCN通道通过Temporoammonic通路（TA通路），使突触对远端腔隙分子层的调节作用大于近端放射层（即Schaffer侧支）。HCN通道的亚细胞分布主要通过孔形成亚基（pore-forming subunits）和TRIP8b（triatricopeptide repeat-containing rab8b interaction）蛋白辅助亚基的结合来调节[9]，TRIP8b与CA1背侧HCN通道的相互作用对于调节动机性行为至关重要[17]。TRIP8b与HCN在两个位点结合，失去任何一个结合位点都会限制HCN在体内的通道传输作用[17]。由于单胺能抗抑郁药物治疗可使cAMP水平显著升高[21]，而TRIP8b与cAMP竞争性结合HCN通道，那么TRIP8b/cAMP对HCN的调节是否与抗抑郁机制有关？
近期，美国西北大学范伯格医学院以及范德比尔特大学神经内科的Kyle A. Lyman（第一作者）、Dane M. Chetkovich（通讯作者）等人合作在Science Translational Medicine上发表了题为“Hippocampal cAMP regulates HCN channel function on two time scales with differential effects on animal behavior”的文章，发现了一种依赖cAMP的HCN通道树突表面调控形式，它可以影响动机行为和空间记忆，或许是治疗与慢性应激相关认知缺陷的潜在靶点。
首先，作者通过qPCR检测在死后男性和女性MDD患者海马CA1区均观察到HCN1的表达显著增加（图1），但其他丰富表达的通道基因（如HCN2、PEX5L、KCND2和DLG4）的表达没有差异。
图1 MDD患者CA1区基因表达情况
（图源：Kyle A. Lyman, et al., Sci Transl Med, 2021）
单胺能抗抑郁药物增强海马cAMP信号[21,22]，cAMP增强HCN通道功能[7]，HCN通道功能的增强限制动机性行为[17]，暗示了HCN通道限制单胺能抗抑郁药物治疗效果的可能性。作者通过rM3D(Gs)（一种只由特定药物激活的受体）和CNO（氯氮平-N-氧化物）反应以产生cAMP[23,24]，并通过CaMKII（钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II）启动子调控构建了表达rM3D(Gs)腺相关病毒（AAV）载体（下文称AAV- DREADD），同时应用全细胞记录，观察到CA1锥体神经元在应用CNO后，下垂率（sag ratio）急剧增加（图2 A-C）（下垂率：一种基于HCN通道的电流钳位测量），这表明AAV- DREADD介导的cAMP的增加导致HCN通道功能的增加。接着，作者在小鼠海马背侧注射AAV-DREADD，观察到注射CNO后可使悬尾试验（TST）和强迫游泳试验（FST）的不动时间增加 （图2 D, E）。随后作者又在CNO注射后进行了目标定位记忆试验（OLM），发现小鼠空间记忆表现下降（图2 F, G）。以上行为学结果提示增强cAMP后增强HCN通道功能可导致动机行为表现异常和空间记忆损伤。
图2 CA1区注射AAV- DREADD产生cAMP，cAMP增强影响小鼠行为
（图源：Kyle A. Lyman, et al., Sci Transl Med, 2021）
HCN2突变体HCN2R591E对cAMP不敏感，但仍保留野生型HCN2通道的功能[25, 26]。首先作者发现Hcn2R/R小鼠海马组织的HCN1、HCN2和TRIP8b表达与野生型没有差异（图3 A-D）。其次全细胞记录结果显示Hcn2R/R小鼠CA1锥体神经元下垂率降低 （图3 E, F），当细胞可渗透cAMP类似物8-Br-cAMP（8-溴腺苷-cAMP）存在的情况下，V50超极化（图3 G）（V50：一半的通道打开时的膜电位），并且8-Br-cAMP增加了Hcn2R/R细胞的膜电阻和兴奋性（图3 H, I）。这些结果表明这种膜电阻（Rm）改变类似于对蛋白激酶A（PKA）激活的响应，导致细胞表面Kv通道的移除；通过增强超极化膜电流（Ih）可降低Rm，相反地，通过PKA可提高Rm。
图3 Hcn2R/R动物CA1锥体神经元全细胞记录
（图源：Kyle A. Lyman, et al., Sci Transl Med, 2021）
正如背景部分所介绍的，CA1锥体神经元中HCN通道呈典型的亚细胞分布，这种HCN通道表达（即HCN分布）模式对于由HCN通道介导的突触特异性时间总和（temporal summation）调节至关重要，HCN通道通过Temporoammonic通路（TA通路）调节该时间总和[9]。因此，鉴于上述结果，作者接下来研究了受Ih调控的TA通路。将双极刺激电极放置在CA1锥体神经元TA通路上（图3 J），并全细胞记录HCN通道拮抗剂ZD7288使用前后的TA通路的变化情况。ZD7288增加了Hcn2+/+ 细胞的时间总和，而对Hcn2R/R细胞的时间总和无影响（图3 K, L）。这表明在Hcn2R/R小鼠海马树突中，Ih越低，则TA通路时间总和越大，从而暗示了降低Hcn2R/R小鼠海马Ih，则可增强小鼠机动性行为。
的确，结果显示，Hcn2R/R小鼠在悬尾试验和强迫游泳试验中的不动时间减少（图4 A, B），而将AAV-DREADD注射到Hcn2R/R双边背侧海马，则没有出现这些变化（图4 C, D）；在空间记忆方面，急性cAMP增加对Hcn2R/R小鼠的目标定位记忆试验表现没有影响（图4 E），表明通过HCN通道的cAMP信号转导是导致动物动机行为的减少和空间记忆受损的原因。
西酞普兰（citalopram）是一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，属于单胺能抗抑郁药物。作者发现急性腹腔内给药西酞普兰后Hcn2R/R小鼠动机性行为增加（图4 F），而在海马背侧注射AAV-DREADD，3周后再给药西酞普兰，小鼠不动时间增加，表明海马cAMP的急剧增加限制了对西酞普兰的行为反应（图4 G）。那么，直接上调海马HCN通道的表达是否会有类似的效果？作者又在海马背侧过表达TRIP8b亚型（AAV-TRIP8b），并给予西酞普兰，发现过表达TRIP8b也限制了西酞普兰促进动机性行为的效果（图4 H），表明海马HCN功能的增加可限制抗抑郁药的行为反应。
图4 HCN通道通能对抗抑郁药行为反应的影响
（图源：Kyle A. Lyman, et al., Sci Transl Med, 2021）
由于cAMP能够破坏TRIP8b和HCN之间的相互作用[18]，并结合上述观察到的结果，作者推测，海马中慢性升高的cAMP与急性升高的cAMP应该有相反的行为效果，因为cAMP的慢性升高可能使TRIP8b和HCN的相互作用被破坏，HCN通道表达减少。作者在野生小鼠的海马背侧注射AAV-DREADD，然后给予小鼠CNO或盐水，3周后观察到，AAV-DREADD+CNO小鼠不动时间缩短（图5 A, B），与此结果一致的是，慢性cAMP提高了小鼠在目标定位记忆试验中的表现（图5 C），这表明cAMP的急性和慢性变化通过双向调节HCN通道功能从而对行为产生相反的影响。之后进行的全细胞记录结果显示，膜电位、膜电阻、兴奋性或下垂率没有变化（图5 D-F）。于是作者又使用前述双极刺激电极记录方法研究了TA通路的强度（图3 J）。结果显示只有在慢性cAMP升高（即AAV-DREADD+CNO）条件下，刺激TA通路会产生更高的动作电位（图5 G, H）。
图5 cAMP信号通路慢性升高可提高小鼠机动性行为和空间记忆
（图源：Kyle A. Lyman, et al., Sci Transl Med, 2021）
作者由此推测TA通路强度增加可能与慢性cAMP升高导致树突表面HCN通道丢失有关[18-20]。AAV-DREADD+盐水组小鼠，其细胞在使用HCN通道拮抗剂ZD7288后表现出TA通路时间总和的大幅增加（图6 A, B）而AAV-DREADD+CNO组（3周）小鼠细胞再应用ZD7288后，TA通路的时间总和变化不大，这表明慢性cAMP升高后，树突表面HCN通道丢失。随后又研究了慢性cAMP升高导致HCN通道树突表面表达变化的机制。使用抗HCN1/HCN2抗体和注射AAV-DREADD+CNO/盐水（3周）的小鼠海马进行共免疫沉淀反应，发现使用CNO的小鼠海马中TRIP8b与HCN1结合较少（图6 C-F），HCN1亚基与HCN2亚基结合没有差异（图6 G, H），说明前述结果（图6 A, B）不是HCN亚基变化导致的。这些结果总体表明cAMP的长期升高会破坏TRIP8b-HCN的相互作用，并最终限制HCN通道的树突表面转运。
图6 慢性cAMP升高破坏TRIP8b-HCN相互作用
（图源：Kyle A. Lyman, et al., Sci Transl Med, 2021）
上述结果也暗示了海马内cAMP的长期升高可能改善认知能力的可能性。于是，作者在对小鼠背侧CA1注射AAV-DREADD后进行慢性社会挫败刺激（chronic social defeat，CSD）试验来检测慢性应激对小鼠持久行为变化的影响（图7 A），经过社会互动测试来识别易感类和抵抗类后（图7 B），将易感鼠随机分配给予CNO或者盐水对照。结果显示，慢性饮用CNO（cAMP长期升高）的易感小鼠在目标定位记忆任务中比对照易感小鼠表现得更好（图7 C）。悬尾试验中的不动时间也更短（图7 D）。这些结果表明海马背侧cAMP信号转导的长期升高可逆转慢性应激后的动机性行为和空间记忆缺陷。
图7 慢性cAMP升高对慢性社会挫败刺激（CSD）刺激后动机性行为和空间记忆的影响
（图源：Kyle A. Lyman, et al., Sci Transl Med, 2021）
原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.abl4580
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制版︱王思珍
本文完