Autophagy︱李晓江团队发现非人灵长类动物模型中SQSTM1对TDP-43胞浆聚集清除的新进展
撰文︱殷 鹏
责编︱王思珍
肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、额颞叶变性（frontotemporal lobar degeneration，FTLD）和阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）等神经退行性疾病疾病均因错误折叠蛋白质的累积而导致。SQSTM1（Sequestosome 1），又称p62，是一种多功能泛素结合蛋白，参与泛素蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统两种蛋白降解过程，可选择性清除错误折叠的蛋白质。因此，其功能受损与错误折叠的蛋白质累积及神经退行性疾病密切相关。
TDP-43（TAR DNA-binding protein 43）是一种神经退行疾病的致病蛋白。正常情况下在神经细胞核中分布，参与基因转录抑制、RNA前体剪接等重要过程[1,2]。当TDP-43基因发生异常突变时及在一些神经病理状况中，胞核中TDP-43会转移到胞浆中，造成神经细胞毒性[3,4]。然而，在小鼠模型中绝大部份TDP-43仍累积在细胞核中，无法充分模拟病人脑中TDP-43在胞浆中聚集的病理特点。
基于大动物和小鼠在模拟神经退行性疾病重要病理变化的显著差异，李晓江团队曾在2019年将突变型TDP-43（M337V）表达在灵长类猴和小鼠黑质，发现TDP-43猴出现类似病人中细胞浆TDP-43聚集的病理特征，这与小鼠模型中所观察到的TDP-43在细胞核中累积截然不同[5]，其中仅在人和猴等高等动物中特异表达的水解酶caspase-4剪切TDP-43，使缺失核定位信号的TDP-43片段产物转移到胞浆中[5]。
2021年12月22日，暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院的李晓江团队在《自噬》（Autophagy）杂志发表了题为“SQSTM1 mediated clearance of cytoplasmic mutant TARDBP/TDP-43 in the monkey brain”的研究论文。该研究通过对比TDP-43小鼠模型，发现非人灵长类猴中SQSTM1基因受TDP-43的特异性调控以其在清除胞浆聚集体中的作用，又一次证明了利用非人灵长类动物模型研究神经退行性疾病的重要性。暨南大学的殷鹏研究员为第一作者及共同通讯作者，李晓江教授为文章的通讯作者。
在本文中，作者首先利用病毒载体介导表达的突变型TDP-43（M337V）食蟹猴和小鼠模型皮层组织，采用荧光染色发现，TDP-43在猴模型中，表现为胞浆聚集体形式，并且可见与SQSTM1蛋白的共定位信号，这与ALS、FTLD等疾病病理上特征类似（图1 A）。此外，胞浆中的TDP-43还能特异性地促进灵长类SQSTM1（p62）mRNA的不稳定性（图1 B），从而造成SQSTM1蛋白表达降低，以及自噬清除功能的受损（图1 C），但此现象并未发生在小鼠模型中。
图1 在突变TDP-43灵长类猴模型，而非小鼠模型中，胞浆TDP-43产物可促进SQSTM1 mRNA的不稳定性，造成自噬功能异常。
（图源：Yin P, et al., Autophagy, 2021）
mRNA的3’端非翻译区（3'UTR）与转录后基因表达关系密切，对mRNA稳定性及亚细胞定位等生物学过程具有重要调控作用[6,7]。作者通过对比人、食蟹猴和小鼠中SQSTM1 mRNA的3’UTR区序列，发现在灵长类（人和猴）的3’UTR区中，SQSTM1 mRNA具有较长的(TG)n重复序列，而在小鼠中，此重复序列仅为4个(TG)重复序列（图2 A）。因此作者首先通过RNA免疫沉淀（图2 B, C）并联用RIP-Seq测序技术，发现TDP-43胞浆片段的表达可特异性结合人源SQSTM1 mRNA的3’UTR区（图2 D, E），从而促进灵长类SQSTM1 mRNA的降解。但在小鼠中SQSTM1的3’UTR区缺乏较长的(TG)n重复序列而不被TDP-43结合，因此并无SQSTM1表达水平的变化。
图2 灵长类SQSTM1的3’UTR区较长的(TG)n重复序列可结合TDP-43，而小鼠中短的 (TG)n重复序列不结合TDP-43。
（图源：Yin P, et al., Autophagy, 2021）
接下来，作者验证了SQSTM1介导的自噬功能异常对TDP-43聚集体的清除作用。发现纠正SQSTM1的表达水平以及激活自噬调节途径，均可促进片段化TDP-43胞浆聚集体的清除（图3 A, B）。并且在突变型TDP-43模型猴脑中表达病毒载体介导的SQSTM1时，可恢复自噬清除功能及促进TDP-43片段化聚集产物的减少，从而解释了ALS/FTLD等疾病进程中的功能性SQSTM1对清除错误折叠蛋白的重要作用（图3 C, D）。
图3 灵长类中特有的caspase-4剪切TDP-43，使其累积在胞浆导致细胞毒性；而SQSTM1可促进TDP-43聚集体的清除。
（图源：Yin P, et al., Autophagy, 2021）
虽然在灵长类细胞中表达突变型TDP-43可用来研究胞浆聚集体的病理机制，但往往过表达TDP-43具有一定的细胞毒性，也无法反映细胞核中正常TDP-43丢失所造成的毒性假说，因此有必要对内源性TDP-43进行基因编辑使其产生突变蛋白来更好地阐述突变TDP-43的神经细胞毒性。此外随着大动物模型在基础医学，尤其神经科学研究上的应用逐渐增多，非人灵长类猴资源紧缺及其在饲养、维护和操作上有诸多限制，研究者们需通过借鉴猴模型上发现的新机制，对小鼠模型进行开发改造，使其更好地模拟疾病的病理现象。
原文链接：https://doi.org/10.1080/15548627.2021.2013653
李晓江实验室合照：殷鹏研究员（左三）为第一作者及共同通讯作者，李晓江教授（左五）为文章的通讯作者，以及其他主要贡献者。
（照片提供自：李晓江实验室）
暨南大学郭祥玉（右三）、李邦（右一）副研究员等也参与了本项目的研究。暨南大学附属第一医院影像中心王璐研究员等为猴影像学观察做出了重要贡献。暨南大学李世华教授（左六）亦为文章的共同通讯作者。本研究获得广东省科技厅项目，科技部国家重点研发计划，国家自然科学基金及广东省非人灵长类动物模型研究重点实验室平台的资助。
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【6】Nat Commun︱星形胶质细胞抑制非人灵长类脑缺血损伤中外周巨噬细胞的浸润
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参考文献（上下滑动查看）
[1] Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell 136:1001–1004.
[2] TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol 6:211–220.
[3] TDP-43 in familial and sporadic frontotem -poral lobar degeneration with ubiquitin inclusions. Am J Pathol 171:227–240.
[4] Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science 314:130–133.
[5] Caspase-4 mediates cytoplasmic accumulation of TDP-43 in the primate brains. Acta Neuropathologica 2019.
[6] Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs[J].Trends in Cell Biology,2015,26(3):227-237.
[7] RNA:3'UTR alternatives to protein localization[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology,2015,16(6):327-327.
[8] A Huntingtin Knockin Pig Model Recapitulates Features of Selective Neurodegeneration in Huntington's Disease. Cell. 2018.
[9] Lack of association of somatic CAG repeat expansion with striatal neurodegeneration in HD knock-in animal models. Human Molecular Genetics. 2021.
[10] CRISPR/Cas9-mediated PINK1 deletion leads to neurodegeneration in rhesus monkeys. Cell Research. 2019.
[11] PINK1 kinase dysfunction triggers neurodegeneration in the primate brain without impacting mitochondrial homeostasis. Protein Cell. 2021.
制版︱王思珍
本文完