Nat Neurosci综述︱双光子全息光遗传学技术探测神经编码

来源︱枢密科技

撰文︱枢小密

责编︱王思珍 

神经科学中对神经元进行特异性干预是理解神经环路如何编码信息和驱动行为必不可少的手段。光遗传学通过对特定的细胞类型进行精确干预以及其快速和可逆的神经调节方式，已经彻底改变神经科学家对神经科学的研究范式。

利用光遗传学在完整的大脑中可进行图形化重建。采用单光子激发的图形化重建具有很大的优势，例如：所需的硬件使用相对简单且成本较低、比较容易地同时刺激大量神经元、激光产生的热量较低。然而，脑实质的散射效应却严重地影响图像的分辨率。目前单光子光遗传学无法在高度分散的脑组织中重建精确的、细胞特异性的时空活动模式，这使得特异性解码神经元的特定动力学特征变得具有挑战性，例如运用单光子光遗传学目前无法解决神经元尖峰放电的尖峰频率、神经同步性和神经网络对感觉、认知和行动的影响。

而双光子光遗传学在高度散射的脑组织具有很高的空间和时间精度，并且光遗传学的视蛋白的表达相对集中。图形化重建的双光子光遗传学能对神经元集合进行控制，通过同步的双光子功能成像，神经科学家可以非常精确地“读取”和“改写”神经活动模式。

2021年8月，加州大学伯克利分校分子和细胞生物学系、和海伦·威尔斯神经科学研究所（the Helen Wills Neuroscience Institute）的Hillel Adesnik和Lamiae Abdeladim在Nature Neuroscience发表了题为“Probing neural codes with two-photon holographic optogenetics”的综述文章，总结了双光子全息光遗传学的最新进展和相关的技术挑战，并概述了双光子全息光遗传学适用的实验范围。双光子全息光遗传学可加快神经科学发展的步伐，并给神经系统功能紊乱的原因提供新的见解。

双光子光遗传学的视蛋白

视蛋白的生物物理特性对双光子光遗传全息成像实验的成功至关重要。传统的视蛋白（如ChR2）由于其自身相对较低电导率，可能需要大量的视蛋白表达才能在双光子刺激下诱发动作电位。因此双光子光遗传全息成像进展的关键问题之一，是优化视蛋白，使之对光更敏感，并具有更大的电导率。

图1 双光子全息光遗传学

（图源：Adesnik H, Abdeladim L, Nat Neurosci , 2021）

Chronos视蛋白单点突变设计出了超快响应视蛋白Chrome，Chrome对光响应的电流是Chronos的四倍，因此在激活神经元中效率更高。在Chrome的基础上，通过工程学的改进，研发出了更强的响应的视蛋白ChroME2f和ChroME2s，在响应程度更大的基础上，优化了快速动力学响应的特点。此外，天然结构的视蛋白CoChR和ChRmine也被用于双光子光遗传学的研究进展中，但是相对于工程学改造的视蛋白，CoChR和ChRmine的动力学特点相对较慢。

在双光子光遗传学中，诱导神经元超级化的视蛋白可以抑制特定类型的神经元活性。GtACRs是一类新发现的阴离子通道，其自身具有极高的电导率，具有很高的超级化特性。传统光遗传学（如eNpHR）光抑制的功率比光激发的功率要大得多，因为不清楚神经元出现动作电位的具体时间，需要持续性地进行光抑制，因此有可能导致脑区局部温度过高。而通过双光子激发的GtACRs可以很好地解决这一问题。

双光子光遗传学面临的挑战

虽然双光子光遗传学在精确调节神经活动方式上具有很大的优势，但在扩大其实用性和提高其精确度之前，仍有几个关键问题必须被解决。

一、如何有效的实现单细胞分辨率

虽然多光子成像可以在大脑中实现较高的光学分辨率，但大量的实验发现，在一些情况下多光子光遗传成像的分辨率要大于神经元单细胞的分辨率。“单细胞分辨率”是指光遗传学只激活目标神经元，而对附近的其他神经元没有显著的影响。解决这个问题的方法之一，是使用Cre-off病毒载体系统驱动视蛋白只表达在目标神经元中，但是仍难做到在单细胞分辨率尺度下进行特异性干预。不能排除临近神经元对目标神经元的影响。为了保证单细胞分辨率，光激活的脱靶效应也是需要考虑的因素。

实现单细胞尺度的绝对精确度还有几个必须考虑的问题：在目标神经元胞体上（而不是突触）表达视蛋白来驱动动作电位、神经元在脑实质中的密度，细胞间视蛋白表达的异质性，以及相似亚型的神经元之间兴奋性的异质性。

尽管存在上述的挑战，神经科学家还是提出了一些方法来提高全息成像的保真度。第一，增加视蛋白的单通道电导，这样就可以用较低的功率来诱导神经元动作电位，进而减少目标偏离效应。第二，将视蛋白集中表达于胞体，以减少对其他神经元的激活。第三，减少视蛋白的表达，使可兴奋的神经元彼此之间空间距离更远。第四，向每个神经元提供较少能量的激发光诱导神经元动作电位，这可能有助于最大限度地提高空间保真度。 

图2 提高双光子全息光遗传学的空间保真度

 （图源：Adesnik H, Abdeladim L, Nat Neurosci , 2021）

二、如何捕获更多神经元集合

双光子激光扫描显微镜可以成像数千个神经元的活动，在动物的一些行为中可能需要大量的神经元共同激活，因此使用双光子全息光遗传学进行研究有很大优势。同时控制一个全息范围内的的神经元数量有两个限制因素：视蛋白的效率和激光的功率。将多个高能激光器件组合到一个显微镜中能提高激光功率，但会导致脑区局部温度过高。因此，优化视蛋白是增加控制神经元集合的有效方式。

三、中尺度双光子全息光遗传学

动物的行为依赖于多个脑区之间的互动，而要了解一个脑区的活动模式如何导致下游区域的特定活动模式，在光调控的同时，需要准确读取这些区域的数据。中尺度双光子显微镜，可在大于5毫米的观察场内实现同时成像，为同时测量多个相关大脑区域的神经元活动提供可行性，但目前成像的像素有待进一步提升。

四、深部脑区的双光子光遗传学

在哺乳动物由于脑实质的散射，传统双光子成像很难对深部脑区进行成像。以往研究采用的研究方案有：移除目标脑区上的脑组织、植入GRIN透镜或其他光学元件。这些方案可同样适用于双光子光遗传学。目前最好的成像方案是使用三光子激发，三光子激发的深度可达到1.5毫米，对目前中等深度的结构成像很有帮助，但需要更高的脉冲能量，这可能会导致脑区局部温度过高或组织损伤。

五、自由活动小鼠的双光子光遗传学

到目前为止，几乎所有双光子全息光遗传学研究都需要在显微镜下对小鼠的头部进行固定。通过使用灵活的光纤系统，在自由活动的动物中进行远程单细胞分辨率的多光子成像和光遗传学调控目前有很大的可行性。可以将显微镜耦合到光纤束上，光纤束通常从输出面进一步连接到微GRIN透镜。

图3 双光子全息光遗传学的研究方案

（图源：Adesnik H, Abdeladim L, Nat Neurosci , 2021）

全息光遗传学成像的优化

全息光遗传学成像最大的缺点是神经集合之间的干扰。双光子全息光遗传学的精确度提供了激活视野内干预任意神经集合的能力，然而，由于实验测量中脑区存在大量的噪音，因此需要在相同干扰重复水平上进行研究。最简单的方法是一次只刺激一个神经元，并计算神经元对神经网络的影响，由于大多数单个神经元的净影响相当小，所以需要多次实验，因此每个实验只能检测到单个神经元影响的一小部分。更重要的是，仅对单个神经元干预，可能无法引起任何行为学效应。

近期大多数全息光遗传学关注于神经元集合的研究中，研究人员可根据神经元对感觉或认知特征的共同反应进行分类，进而全息成像同一共同特征的神经元集合。此外，研究人员还计算分析神经元的生理数据，进而将神经元进行分类。对同一类型神经元的最小集合进行光遗传学干预，进而确定引起行为学效应的最小神经元集合。

图4 双光子光遗传学揭示驱动行为效应的神经集合

（图源：Adesnik H, Abdeladim L, Nat Neurosci , 2021）

全息光遗传学成像的优化

一、解析视觉感知中神经元的尖峰放电和同步性

在视觉皮层中神经的同步对感觉知觉的影响是感觉神经科学中最著名的争论之一。而双光子全息光遗传学为解决这一争论提供了途径。首先，可以在相关的视觉皮层神经元集合中诱发动作电位，诱发动作电位的强度需要驱动视觉辨别任务。其次，在行为响应的时间内计算完全相同数量的尖峰放电，研究不同神经集合表现出不同程度的同步性情况，并分离出具有相同同步性的神经元集合。这样子就可以判断单位时间内神经元的尖峰放电和同步性对视觉感知是否存在影响。

二、解决脑区噪音对感官知觉的影响

大脑皮层的神经元在相同的刺激下，其放电呈现高度的波动性。不同神经元的电信号就会成为研究目标神经元的噪音。尽管噪音已被广泛用于研究神经环路中的整体结构，但这些噪音与功能的相关性目前仍不清楚。全息光遗传学可以对这一问题进行探索性实验研究。在用全息光遗传学的感知研究中，通过任意控制光刺激组合的激发频率，可以将噪声相关性降低，并探索对行为的影响。

三、探讨神经活动模式对功能的影响

突触连接聚焦于神经元的突触部分，是神经集群活动中最小的功能模块。双光子全息光遗传学可以干预神经网络最小功能模块，同时跟踪下游神经元活动和行为学效应。然而，目前双光子光遗传学最关键限制是视野问题，因为视野范围外的许多相同的神经集群仍是神经网络的一部分，也会对行为造成影响。

四、探索突触可塑性在学习过程中对神经网络的影响

突触的快速、动态变化对学习和记忆的形成至关重要。经验依赖的突触活性改变是编码记忆相关神经环路的重要基础。全息光遗传学通过与钙成像相结合可以在毫秒级别到数天的大跨度时间尺度上研究数百个神经元对学习记忆的响应。

图5 使用多光子全息光遗传学处理神经代码和可塑性规则的例子

 （图源：Adesnik H, Abdeladim L, Nat Neurosci , 2021）

结论与讨论，启发与展望

在过去15年中光遗传学已经彻底改变了实验神经科学，但是传统的单光子光遗传学方法仍难以解决脑功能基本问题。相对于单光子光遗传学，双光子光遗传学可以提供更清晰的空间分辨率，有利于重建特定行为范式中精确的神经活动模式。此外双光子全息光遗传学在未来有可能成为治疗性光-脑接口的基础，并利用全息光遗传学的精确的分辨率，特异性干预目标神经元集群，可为有视觉或听觉障碍的患者研发出更具真实感的人工假体，并有可能通过闭环空间的精确干预治疗认知和情感障碍性疾病。

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原文链接：https://doi.org/10.1038/s41593-021-00902-9 

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