Cell Death Dis︱孔慧等揭示P2X7/NLRP3炎症小体通路在早期糖尿病视网膜病变中的作用

撰文︱孔慧，陈天然，崔彦

责编︱王思珍

糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常见的并发症，可导致严重的视力损害和失明。视网膜内皮细胞（RECs）是参与DR的主要细胞类型之一[1]。在DR的早期阶段，低灌注可能导致视网膜毛细血管的低级别慢性血管炎症（白细胞淤积）和进行性和不可逆的缺氧，最终导致微动脉瘤和脱细胞毛细血管[2]的形成。RECs是糖尿病诱导的血管损伤的主要靶细胞，RECs的改变在视网膜疾病的发展中起着至关重要的作用，是DR的一个标志。P2X7/NLRP3通路通过ATP反馈回路放大炎症，促进炎症反应、焦亡和凋亡，发挥重要作用。

高血糖和糖尿病代谢变化引起的炎症损伤视网膜神经血管单元（retinal neurovascular unit，RNUT），导致渐进性和进行性神经病变。P2X7/NLRP3信号通路在神经炎症放大中发挥重要作用。神经炎症通过风险相关分子模式（DAMPs）与P2X7R的激活积极相关，其中主要的是细胞外ATP，在ATP短暂刺激下，P2X7受体阳离子通道打开, 导致K⁺外流以及Na⁺、Ca²⁺内流。在ATP持续刺激下，P2X7受体会形成非选择性膜孔，允许一些相对分子质量达900 kD的物质进入细胞内，导致细胞死亡。CD40-ATP-P2X7信号通路介导RNUT细胞间信号串扰，促进内皮细胞的程序性死亡，在DR的发展中至关重要[2]。P2X7激活后导致的K⁺外排、钙调节失调和谷氨酰胺外排，是NLRP3炎症小体激活的主要机制[3]。NLRP3炎症小体由NLRP3、接头蛋白ASC和效应蛋白Caspase-1组成。在激活后，NLRP3炎症小体介导caspase-1的激活，将proIL-1β和proIL-18分裂为它们的活性形式。因此对P2X7/NLRP3炎症小体信号通路的研究能够为DR的早期干预和治疗提供新的靶点。 

2022年4月12日，山东大学齐鲁医院眼科崔彦课题组孔慧博士等人在Nature子刊Cell Death Disease上发表了题为“Targeted P2X7/NLRP3 signaling pathway against inflammation, apoptosis, and pyroptosis of retinal endothelial cells in diabetic retinopathy”的研究论文，提出了P2X7/NLRP3炎症小体通路通过ATP正反馈回路放大视网膜血管内皮细胞炎症反应、促进细胞焦亡和凋亡，在早期糖尿病视网膜病变的内皮炎症损伤中发挥重要作用。孔慧博士为论文第一作者，崔彦教授为论文通讯作者。

在此项研究中，作者首先发现，对雄性6周龄C57BL/6J小鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病模型，建模成功后靶向抑制P2X7/NLRP3通路，糖尿病小鼠外周血血浆上清液LPS水平升高，视网膜中的P2X7和NLRP3以及下游炎症因子和凋亡蛋白表达升高，加入3TC（一种核苷类逆转录酶抑制剂）治疗后，视网膜炎症因子IL18、IL1β、ICAM1表达降低，血管渗透减少（图1）。

图1 STZ诱导的糖尿病小鼠中，P2X7/NLRP3通路及下游炎症因子表达升高，毛细血管渗出增加。抑制DR小鼠中的P2X7/NLRP3信号通路，炎症因子表达降低，无细胞毛细血管面积减少，渗出减少。

（图源：Kong H et al., Cell Death Dis, 2022）

在体外实验部分，作者验证了P2X7/NLRP3炎症小体通路对视网膜内皮细胞的影响。体外高糖培养mREC凋亡率升高；相比较于单独高糖诱导，高糖诱导和LPS/BzATP/TNF-α的共同应用可显著增加IL-18、IL-1β和ATP的分泌、以及细胞凋亡（图2）。分别应用P2X7和NLRP3的特异性抑制剂A740003、3TC和MCC950抑制P2X7/NLRP3通路后，IL-18、IL-1β和ATP的分泌，Casepase1/3/11均降低，显著降低了细胞的凋亡率，逆转了高糖和LPS的有害影响。这些结果证实了P2X7/NLRP3通路参与了糖尿病视网膜功能障碍的发病机制，以及3TC在抑制糖尿病内皮损伤方面的治疗潜力（图3）。

图2 高糖培养加入LPS刺激，P2X7/NLRP3通路及下游炎症因子表达升高，mRECs的凋亡和焦亡增加。 

    （图源：Kong H et al., Cell Death Dis, 2022）

图3 3TC抑制P2X7和NLRP3炎症小体通路减轻高糖和LPS诱导的mRECs的凋亡和焦亡。

（图源：Kong H et al., Cell Death Dis, 2022）

ATP是NLRP3激活和IL-1β成熟的有效诱导剂，同时也是P2X7的唯一生理性激动剂。糖尿病高血糖和高LPS水平激活P2X7，通过促炎细胞因子以及ATP释放和大孔形成双重机制诱导REC死亡。P2X7激活后通过K⁺外流、ROS和谷胱酰胺外排等方式激活NLRP3炎症小体，而LPS的刺激通过Caspase-1经典途径和Caspase-11非经典途径介导NLRP3炎症小体诱导焦亡。Caspase11的结构card域可以识别LPS形成寡聚复合物而被激活，活化的Caspase11剪切GSDMD羧基端，形成一个GSDMD-NT活性片段，多个GSDMD-NT段迁移到细胞膜，形成稳定的环形孔，内外径分别为15 nm和32 nm，导致细胞焦亡。Pannexin1（PANX1）是一个介导ATP释放的通道，PANX1的激活需要Caspase11介导的C端裂解，Caspase11能够激活pannexin-1通道导致ATP释放，进一步放大P2X7介导细胞毒性[4]。活化的Caspase11同时激活NLRP3/ASC-Casp-1通路，导致促炎因子IL-1β和IL-18成熟和分泌。

图4 文章总结图：P2X7介导NLRP3典型的和非典型激活诱导细胞焦亡。

       （图源：Kong H et al., Cell Death Dis, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

ATP可能是最原始的细胞外信使，在生理条件下，ATP以少量存在于细胞外空间（nmol/l）[5]。其次，它们被大量储存在细胞内（从5-10 µmol/l）[6]。细胞外ATP在病理条件下可能作为一种“危险”信号。几乎所有的细胞都能在特定的刺激下在细胞外释放ATP。ATP可以在细胞损伤和死亡后被释放出来，也可以通过不同的通道从活细胞中释放出来[7]。其释放机制包括分泌性胞吐作用、连接蛋白或泛连接蛋白半通道、ATP结合盒（ABC）转运体、钙稳态调节剂（CALMH）通道、ATP门控P2X7R和两类通道最大阴离子通道(MACs)和体积调节离子通道（VRACs）。

该团队的研究证实了DR时高糖和高LPS环境诱导小鼠RECsP2X7大孔开放，并介导ATP自分泌反馈回路激活炎症小体通路，触发NLRP3炎症小体的组装和继续释放，放大和延续炎症反应，并诱导P2X7和NLRP3依赖的焦亡，而3TC，最早用来治疗HIV的一种核苷逆转录酶抑制剂，能够抑制P2X7受体，通过靶向抑制P2X7/NLRP3信号通路，保护内皮细胞免受凋亡、降低视网膜炎症，对早期DR有治疗作用（图4）。

该团队提出P2X7/NLRP3炎症小体通路参与了早期糖尿病视网膜病变，在内皮细胞的炎症、凋亡和焦亡过程中起到了至关重要的作用，这为DR炎症机制的研究提供了的方向，也为早期DR药物治疗提供的新的靶点（图4）。

该研究尚有局限性，对于P2X7从离子通道转化为大孔的分子基础机制尚不清楚。K⁺外排被广泛认为是NLRP3炎症小体激活的标准上游信号；也有研究表明，细胞外ATP能够导致P2X7受体-paxillin-NLRP3复合物的形成。该复合物的构建通过NLRP3的去泛素化促进了NLRP3炎症小体复合物的组装，这一机制在激活NLRP3炎症激活中发挥了重要作用，这些具体机制在细胞的凋亡和焦亡中所起的作用有待进一步研究。

原文链接：https://doi.org/10.1038/S41419-022-04786-W

第一作者孔慧（左），通讯作者崔彦（右）

（照片提供自：山大齐鲁医院眼科崔彦课题组）

孔慧，眼科学博士，眼科主治医师，研究方向白内障、眼底病。硕士师从于上海交通大学眼科范先群院士，博士师从于山大齐鲁医院崔彦教授，现于千佛山医院眼科工作。

崔彦，眼科学博士，博士生导师，山东大学齐鲁医院眼科主任医师，山东大学眼科学教授。现从事玻璃体视网膜疾病专业。主持多项国自然及省自然科学基金，以第一作者及通讯作者发表SCI论文几十余篇。

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[1] Bharadwaj AS, Appukuttan B, Wilmarth PA, Pan Y, Stempel AJ, Chipps TJ, et al. Role of the retinal vascular endothelial cell in ocular disease. Prog Retin Eye Res. 2013;32:102–80.

[2] Subauste CS. The CD40-ATP-P2X7 receptor pathway: cell to cell cross-talk to promote inflflammation and programmed cell death of endothelial cells. Front Immunol. 2019;10:2958.

[3] Franceschini A, Capece M, Chiozzi P, Falzoni S, Sanz JM, Sarti AC, et al. The P2X7 receptor directly interacts with the NLRP3 inflflammasome scaffold protein. FASEB J. 2015;29:2450–61.

[4] Platania CBM, Giurdanella G, Di Paola L, Leggio GM, Drago F, Salomone S, et al. P2X7 receptor antagonism: Implications in diabetic retinopathy. Biochem Pharm. 2017;138:130–9.

[5] Kayagaki N, Warming S, Lamkanfifi M, Vande Walle L, Louie S, Dong J, et al. Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11. Nature. 2011;479:117–21.

[6] Verkhratsky A, Zimmermann H, Abbracchio MP, Illes P, DiVirgilio F. In memoriam geoffrey burnstock: creator of purinergic signaling. Function. 2020;1:zqaa006.

[7] Giuliani AL, Sarti AC, Di Virgilio F. Extracellular nucleotides and nucleosides as signalling molecules. Immunol Lett. 2019;205:16–24.

制版︱王思珍

本文完