Mol Neurobiol︱俞琼课题组使用生物信息学策略鉴定首发精神分裂症患者外周血miRNA生物标志物
撰文︱金梦迪
责编︱王思珍
制版︱查佳雪
精神分裂症（schizophrenia，SCZ）是一种功能性精神病，影响全球约1%的人口[1]。全球负担相当沉重，尤其是在中等收入国家[2]。然而，目前对精神分裂症的诊断主要基于一系列典型证候、精神病史和临床观察，很大程度上依赖于医生的判断和经验，没有标准化的成像和病理学标准或可检测的生物标志物可用。MicroRNAs（miRNAs）是一类非编码小RNA，可通过在转录后水平与目标3'-UTR序列的不完全碱基配对来调节近三分之一的人类基因[3]。已有充分的证据表明，miRNA参与了精神分裂症等神经精神疾病的生物学变化[4,5]。
外周血采样具有创伤小、低风险、方便重复、能够提供反映机体整体免疫状态的信息等优点，引起了研究人员对外周血miRNA用于治疗监测的关注[6]。已有一些研究发现了可用于SCZ患者的miRNA [7,8]。然而，在解释死后大脑或外周循环中miRNA表达的改变时，很难排除长期治疗和药物的影响[9,10]。在一篇研究不同性别精神分裂症患者miR-195水平与认知障碍之间关系的文章中，Huang等人证明招募首发和无药物使用患者作为研究对象可以排除抗精神病药物对认知和miRNA表达水平的影响[11]。精神分裂症初期miRNAs的改变尚未深入研究，这可能为SCZ的发病机制和早期诊断提供重要线索。
2022年5月23日，吉林大学公共卫生学院的俞琼课题组在《分子神经生物学》（Molecular Neurobiology）上发表了题为“Identification of Peripheral Blood miRNA Biomarkers in First-episode Drug-free Schizophrenia Patients Using Bioinformatics Strategy”的研究论文，利用生物信息学策略和qRT-PCR技术鉴定了多种首发精神分裂症患者外周血潜在miRNA生物标志物。金梦迪为论文的第一作者，俞琼教授为论文的通讯作者。在此研究中，作者发现了三个与首发精神分裂症相关的共表达miRNA模块和39个关键miRNA，它们均显示了FOXO和PI3K-Akt信号通路的显著富集，并靶向调控与SCZ易感性相关的基因。验证队列中的qRT-PCR结果揭示了两种潜在的外周血生物标志物（下调的miR-9-5p和上调的miR-4467）有望用于SCZ的早期诊断，进一步的功能预测显示，这两种miRNAs可能通过靶向调节神经发育相关的mRNA参与SCZ的发生和发展。该研究在生物信息学角度丰富了我们对SCZ相关miRNA的认识，为早期SCZ患者提供新的可验证的生物标志物，并为SCZ的病因机制研究提供了线索。
这项研究招募了15名FES患者和15名年龄和性别匹配的健康对照（CTL）作为高通量测序队列，35名FES患者和年龄性别成组匹配的60名CTL作为验证队列。研究者对参与人员进行血样采集和总RNA提取，并进行质量控制。由北京诺禾致源基因实验部对测序队列的RNA进行高通量测序。
为了筛选与首发精神分裂症（first-episode schizophrenia，FES）相关的miRNA，作者首先对测序得到的miRNA表达谱进行标准化差异分析。使用R软件对75%以上的样本中表达的miRNAs进行过滤，对高通量测序产生的read counts进行标准化。FES患者和健康对照之间的差异表达的miRNA分别由三个R包（limma、DESeq2和edgeR）识别，筛选标准最初设置为|log2FC| > 0.5 和p < 0.05（图1A）。相关分析显示三个log2FC之间的高度相关性（图1B），表明差异分析结果的可靠性。最终，作者选择了三部分结果的交集，得到了79个表达的miRNAs，其中与健康对照组相比，FES患者中49个miRNA上调，30个miRNA下调（图1C）。
图1 FES和健康对照组外周血样本中差异表达的miRNA
（图源：Jin M, et al., Mol Neurobiol, 2022）
大多数现有的SCZ生物标志物研究都是基于测序和筛选差异表达的miRNA。由于SCZ是一种典型的复杂疾病，除了单个的miRNA表达的改变外，miRNA之间复杂的共表达关系也不容忽视。加权基因共表达网络分析（WGCNA）是一种分析多个样本的miRNA表达模式的方法，它并不特别强调差异表达，而是侧重于一系列miRNA之间的共表达模式和关联，这可能为SCZ生物标志物的开发提供附加信息。因此，作者利用R中的WGCNA包，以无尺度拓扑拟合指数达到0.91时的β=6作为软阈值，minModuleSize = 20，mergeCutHeight = 0.2为主要参数，通过动态剪切法在所有样品中聚集了9个共表达的miRNA模块（图2A）。作者采用拓扑重叠度量（TOM）计算miRNA之间的相关程度，建立TOM矩阵，并根据节点差异（1-TOM）对miRNA进行层次聚类分析（图2B）。模块之间的聚类和相关分析表明，精神分裂症与蓝色和粉色模块有很强的相关性（图2C）。随后作者计算了模块特征基因（module eigengene，ME） 与参与者特征之间的 Pearson 相关系数，发现蓝色、粉色和黄色模块与FES显著相关（所有p < 0.1），这些模块被定义为关键模块（图2D）。
图2 加权基因共表达网络的构建和精神分裂症相关模块的识别
（图源：Jin M, et al., Mol Neurobiol, 2022）
可重现的miRNA共表达模块通常具有稳定的内部结构、样品中固定的共表达模式和特定的生物学功能。为了避免某些miRNA的共表达关系仅来自一小部分样本，作者使用了Peter Langfelder等人提出的两种方法，验证共表达模块的可重复性[12,13]。随机抽取总样本的70%作为测试数据集，使用Fisher精确检验计算每个共表达模块与实验数据集上所有共存模块重叠的显著性，显著性阈值为0.01。当共表达模块与一个或多个共存模块显著重叠时，该模块被认为是保守的（图3 A）。另外，作者从共表达模块的拓扑结构入手，检测了共表达模块和测试模块中miRNA的连接密度和连通性（图3 B）。以上两个角度均证明这些模块都具有保守性。
图3 模块保守性验证
（图源：Jin M, et al., Mol Neurobiol, 2022）
基因显著性（gene significance，GS）为miRNA与FES患者之间相关性的绝对值，模块成员（module membership，MM）为miRNA表达谱与ME之间的相关性。作者评估了GS和MM的相关性，结果表明，蓝色模块中GS和MM之间的相关性最强（r = 0.53，p = 1 x 10-8），黄色模块次之（r = 0.32，p = 0.0016）（图4 A）。热图和模块特征基因直方图提示ME的表达与整个模块中 miRNA 的表达高度相关（图4 B）。随后，作者选择|MM| > 0.8且 |GS| > 0.2的39个miRNA作为关键miRNA来代表每个模块，其中蓝色模块20个关键miRNA，粉色模块6个，黄色模块13个。作者还对FES相关模块进行了通路富集分析。有趣的是，结果显示这些模块都显著富集于FOXO信号通路和PI3K-Akt信号通路（图5）。关键miRNA靶基因的PPI网络的hub基因筛选提示：AKT1、CCND1和MYC是蓝色模块中的核心hub靶基因；PTEN、MYC、SMAD3为黄色模块的核心节点，AKT1、PTEN、NOTCH1为粉色模块的核心节点。
图4 （A）关键模块中所有miRNA表达水平的热图；（B）关键模块ME值的直方图。
（图源：Jin M, et al., Mol Neurobiol, 2022）
结合标准化差异分析和WGCNA的结果，作者选择DEM和FES相关模块中所有miRNA之间的交集获得41个miRNA（图5 A）。通过全面的文献回顾和更严格的筛选标准（average readcount > 10，|log2FC| > 0.8和p < 0.005），这项研究选择了四种miRNA（miR-9-5p、miR-144-3p、miR-328-3p、miR-4467）用于qRT-PCR 的验证（FES =35，CTL=60）。实验结果表明，与健康对照组相比，FES患者外周血中miR-9-5p的表达显著下调（p = 0.046），miR-4467的表达显著上调（p <0.001）（图 5B）。ROC曲线显示miR-4467对FES患者的区分能力优于miR-9-5p，也优于两者的组合（图5 C）。
图5 miRNA生物标志物的选择和验证
（图源：Jin M, et al., Mol Neurobiol, 2022）
另外，靶基因功能富集结果显示，miR-9-5p主要参与的生物过程（biological process，BP）是运动行为和神经系统发育。细胞成分（cellular components，CC）定位于轴突和突触。而miR-4467的靶基因功能主要体现在DNA结合和转录调控。KEGG通路富集分析显示miR-9-5p靶基因主要富集于神经营养因子、MAPK、雌激素和磷脂酰肌醇信号系统。FBXL3、ASB7、FBXL16、FBXW2和H2AFX在靶基因模块中处于中心位置（图 6）。
图6 miR-9-5p和miR-4467的功能预测和hub靶基因筛选
（图源：Jin M, et al., Mol Neurobiol, 2022）
综上所述，这项研究招募了首次确诊且尚未接受任何抗精神病药物治疗的精神分裂症（SCZ）患者，利用生物信息学策略寻找了SCZ疾病早期的可靠生物标志物。确定了三个首发精神分裂症（FES）相关的共表达miRNA模块和39个关键miRNA。
有趣的是，关键模块和hub基因均显著富集在FOXO信号通路和PI3K-Akt信号通路中。Forkhead box O（FOXO）转录因子家族在细胞生理事件中调节基因的表达，其中就包括抗氧化应激[14]。而精神分裂症的氧化应激假说已被广泛接受，即遗传和环境因素导致氧化还原敏感转录因子等（如FOXO [15]）的异常调节，导致基因表达的失调。FOXO转录因子的活性与磷酸化状态直接相关，而P13K/AKT通路是FOXO磷酸化的重要途径[16]。FOXO特异性氨基酸位点被磷酸化后，从细胞核转移到细胞质，发生泛素化和降解，失去正常的转录活性，抑制其生物学功能。这些变化反映了细胞水平的线粒体功能障碍和代谢异常，导致神经元发育、髓鞘形成和神经递质异常[17]。在整个有机体的水平上，所有这些过程最终可能会促成精神分裂症的表现和发展。因此，这项研究推测关键miRNA调节靶基因以失衡氧化应激并导致FOXO通路异常，这可能是引发精神分裂症的机制之一。
这项研究的另一个主要发现是FES患者中miR-9-5p和miR-4467表达水平的改变，并有望作为FES的新型生物标志物。综合富集分析和hub基因表明，miR-9-5p和miR-4467可能通过靶基因的调控在神经发育和突触传递中发挥作用，这可能有助于精神分裂症的发生和发展。此外，考虑到靶基因群参与神经发育的调控，进一步证明了选择首发精神分裂症患者探索精神分裂症病因和发病机制的意义。
当然，这项研究还存在一些有待解决的问题，比如，研究中只验证了4个hub miRNA，而41个hub miRNA中的其他miRNA也值得挖掘和验证，研究者表示将继续招募样本进行下一步的实验验证。其次，miR-9-5p和miR-4467靶基因的表达水平以及潜在的结合位点值得通过后续细胞水平的研究进一步探索。
该论文通讯作者为吉林大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系俞琼教授，金梦迪博士为该论文第一作者。上述研究工作得到国家自然科学基金项目（81673253）吉林省教育厅科技项目（JJKH20190091KJ）的资助。
第一作者：金梦迪（左），通讯作者：俞琼教授（右）
（照片提供自：吉林大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系俞琼课题组）
作者简介（上下滑动阅读）
俞琼，吉林大学公共卫生学院教授，博士生导师。主要研究方向为分子流行病学，基因组流行病学，精神卫生流行病学，肿瘤流行病学。先后以通讯作者身份在Molecular Neurobiology、Journal of Psychiatric Research、Journal of Neural Transmission、Journal of Affective Disorders等SCI杂志发表论文50余篇。
社会兼职：中华预防医学会老年病预防与控制专委会委员，中国抗癌协会肿瘤流行病学专业委员会青年委员会委员，中华预防医学会伤害预防与控制分会青年委员会委员。
邮箱：yuqiong@jlu.edu.cn
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参考文献（上下滑动阅读）
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本文完