Front Mol Neurosci︱叶小菁/林伟杰团队揭示神经性疼痛引发抑郁共病的关键脑区性别特异性转录表征
撰文︱黄淑颖，戴卫平，林伟杰，叶小菁
责编︱王思珍
制版︱查佳雪
神经性疼痛是由躯体感觉系统病变或疾病引发的疼痛，影响着全球6-8%的人[1-3]。超过60%的神经性疼痛患者同时患有抑郁症，其特征是连续且持久的心境低落以及意志活动减退[4,5]。神经性疼痛合并抑郁症的患者会加剧疼痛感的严重程度并导致不良预后[6-8]。然而，目前对于大脑不同脑区在神经性疼痛和抑郁共病的互作机理，所知仍然十分有限。此外，尽管两性都可能发生疼痛和抑郁问题，但女性比起男性在疼痛易感性和抑郁发病的比例更高，其潜在机制仍未得到充分探索。
疼痛激活的大脑区域又被称为“疼痛相关区域”，内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex，mPFC）和前扣带回皮层（anterior cingulate cortex，ACC）是已知的关键枢纽区域，且与其他参与疼痛和/或情绪处理的脑区存在广泛的神经连接[9-14]。
慢性疼痛，包括神经性疼痛，会以不同方式改变mPFC和ACC的结构和活性。人类和动物研究都表明，慢性疼痛可导致大脑灰质体积减少，并降低mPFC神经元活性[15-18]。使用药理学或光遗传学激活mPFC，则可减轻伤害性感受以及疼痛导致的抑郁样行为，表明疼痛的感觉和情绪可以经由mPFC调节[13,19-22]。然而有趣的是，与mPFC活性降低相反，慢性疼痛可导致ACC活性的异常升高，增加疼痛易感性并导致抑郁。在人类功能磁共振成像(fMRI)研究中也观察到慢性疼痛患者ACC过度活跃，此一现象并在慢性疼痛动物模型中通过电生理记录得到证实[23-25]。研究发现，ACC的损伤或活性降低可显著缓解神经性疼痛引起的抑郁样行为，对于机械性痛觉感受的影响仍未有定论[13,26,27]。然而，慢性疼痛引发mPFC和ACC出现相反变化的相关机制尚未明确，仍有待进一步研究阐明。
2022年5月18日，中山大学中山医学院叶小菁团队联合中山大学孙逸仙纪念医院林伟杰团队在Frontiers in Molecular Neuroscience上发表了题目为“Sex-Specific Transcriptomic Signatures in Brain Regions Critical for Neuropathic Pain-Induced Depression”的研究论文，揭示了神经性疼痛诱导mPFC和ACC脑区转录水平的特异性和性别二态性，为阐明在疼痛合并抑郁症的早期发展过程中，不同性别差异调节关键脑区的分子机制提供了新的见解，并为慢性疼痛及其相关情感障碍的治疗提供了新思路和可能靶点。
神经性疼痛是一种慢性疾病，与抑郁症具有高共病性。为了对神经性疼痛合并抑郁症背后的可能机制进行研究，研究人员首先建立了经典的神经性疼痛模型——坐骨神经分支选择性损伤（spared nerve injury，SNI）的动物模型。结果发现，在雌性和雄性小鼠中，SNI都会引发疼痛易感性增加和抑郁样行为（图1）。
图1 雌雄小鼠在SNI术后2周和4周时出现机械性疼痛易感性增加和抑郁样行为
（图源：Xiaojing Ye, et al., Front Mol Neurosci, 2022）
临床报告和动物研究表明，内侧前额叶皮层（mPFC）和前扣带皮层（ACC）与调节神经性疼痛的易感性和抑郁样症状密切相关，且神经性疼痛在mPFC和ACC这两个脑区能够引起不同结构、功能和生化变化，被认为受到多重基因转录的调控。然而，先前的研究仅针对SNI造模术后2.5-6个月的时间点进行大脑转录组分析，对于SNI早期mPFC和ACC脑区因神经性疼痛引发的转录谱差异仍然未有报道。因此研究人员选择在SNI后2周，小鼠开始表现出轻度抑郁表型的时间点，对mPFC和ACC的转录谱变化进行不同性别的系统性研究，以期进一步确认在神经性疼痛的早期进展过程中与疼痛易感性及抑郁样表型相关的潜在分子特征（图2）。
图2 特异性脑区转录谱测序和后续分析的实验设计流程
（图源：Xiaojing Ye, et al., Front Mol Neurosci, 2022）
研究人员首先在SNI手术或假手术2周后，收集雌雄小鼠的mPFC和ACC脑区进行bulk-RNAseq测序。分析结果显示，在ACC中雌性小鼠表现出比雄性小鼠更显著的转录组变化，而在mPFC中则出现相反的模式，即雄性小鼠转录组变化比雌性小鼠更为显著（图3A-B）。值得注意的是，在SNI雄性小鼠mPFC脑区发现到的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）中，显着下调的基因包括了与神经髓鞘形成密切相关的Mal（编码髓鞘和淋巴细胞蛋白）、Mbp（编码髓鞘碱性蛋白）和Cnp（编码2',3'-环核苷酸 3'-磷酸二酯酶）。在雌性小鼠ACC脑区中，值得注意的转录组变化则包括了Syt6和Syt2的上调，它们编码突触前蛋白突触结合蛋白，对神经递质释放具有重要调控作用，其他下调的基因还包括Col3a1的和Col1a1，分别编码I型和III型胶原蛋白，是细胞外基质的主要成分（图3C-F）。
图3 不同性别小鼠的mPFC和ACC脑区中SNI后的转录谱变化
（图源：Xiaojing Ye, et al., Front MolNeurosci, 2022）
对不同组之间的DEGs进行进一步的比较后，研究人员发现，不同脑区和不同性别之间几乎没有共同的差异表达基因（图4A）。将DEGs生成热图则显示，部分DEGs在两性中表现出相似的变化方向，但变化幅度具有性别特异性，部分DEGs则表现出特定性别的变化，甚至在不同性别间有着相反的变化方向（图4B-C）。这些结果首次表明，SNI术后2周，mPFC和ACC脑区的转录谱已可观察到高度差异和性别特异性变化。
图4 不同性别小鼠的mPFC和ACC脑区中SNI后的转录谱变化
（图源：Xiaojing Ye, et al., Front Mol Neurosci, 2022）
为了研究SNI造模后不同性别小鼠mPFC和ACC中的DEGs相互作用和潜在的关键驱动因子，研究人员基于STRING蛋白质-蛋白质相互作用数据库进行了网络分析，并进一步使用cytoHubba的MCC分数来识别顶级中心DEGs及其子网络。结果发现，在雄性mPFC中，前20个中心DEGs构成一个子网络，共同参与调控神经系统发育和轴突髓鞘的形成。对于雌性ACC，前8个中心DEGs形成一个子网络，编码细胞外基质的成分。值得注意的是，在雄性mPFC网络的顶级枢纽DEGs中，Mal（髓磷脂和淋巴细胞蛋白）、Cnp（2',3'-环核苷酸 3'-磷酸二酯酶）、Plp1（蛋白脂质蛋白1）、Mobp（髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白）、Mbp（髓鞘碱性蛋白）和Mog（髓鞘少突胶质细胞糖蛋白）在功能上与髓鞘形成过程相关，也是SNI造模2周后表达呈现显着下调的DEGs（图5A）。同样地，在雌性ACC网络中，枢纽DEGs包括Col3a1（胶原蛋白III型alpha 1链）和Dcn（核心蛋白聚糖）是细胞外基质的重要组成部分，它们也是SNI后表达下调最显着的前20个DEGs之一（图5B）。雌性mPFC和雄性ACC由于鉴定出的DEGs数量有限，并没有观察到任何网络结构。这些数据表明，雄性mPFC髓鞘形成减少和雌性ACC细胞外基质异常可能是SNI诱导神经性疼痛和抑郁共病的早期关键因素。
图5 雄性mPFC和雌性ACC中DEGs的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络
（图源：Xiaojing Ye, et al., Front Mol Neurosci, 2022）
为了对SNI手术后2周mPFC和ACC转录谱变化进行功能定义，研究人员使用了基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）手段。结果发现，SNI造模后2周，SNI组雌性和雄性mPFC均出现与髓鞘发育相关功能基因集显着去富集化，而同样出现去富集化的，还有雌性在SNI组的mPFC中与轴突导向因子通路semaphorin plexin signaling，以及胶质细胞增生分化相关的基因集。雄性SNI组mPFC中则观察到与线粒体结构，核膜核苷三磷酸酶调控，以及突触调控相关的基因集出现显着富集。在雌性ACC中，线粒体呼吸链复合体组装，转酯化反应介导RNA剪接, 以及轴突和神经突触连接等相关功能基因集在SNI组显著富集，而细胞外基质的基因集在SNI后出现去富集化，而雄性ACC中则不存在此类特征（图6A-D）。这些结果揭示了SNI术后2周的mPFC和ACC转录谱具有显著的功能通路差异和性别特征。
图6 SNI后2周不同性别小鼠mPFC和ACC转录组变化的基因集富集分析(GSEA)
（图源：Xiaojing Ye, et al., Front Mol Neurosci, 2022）
以往疼痛及其相关情感障碍的临床前研究，在很大程度上依赖于雄性啮齿动物。较少有文章系统性比较不同性别之间的相似性和差异。在本研究中，研究人员首先比较了坐骨神经分支选择性损伤（SNI）术后雌雄小鼠对机械性疼痛的易感性变化和抑郁样行为的结果，没有发现到显着的性别差异，然而机械性疼痛阈值在雌性小鼠有较大程度的降低。研究人员推断有几个因素可能导致其行为测试中缺乏性别差异。首先，SNI是一种对疼痛感觉神经纤维产生强烈而持久刺激的模型，这种刺激难以耐受，而对疼痛敏感性的性别差异可能需要使用较低程度的疼痛刺激才能检测到。其次，对慢性疼痛的耐受性和相关抑郁样表型的性别差异，目前的研究仅测试了SNI造模后前4周的行为学变化，但性别导致的表型差异可能需要更长时间后才能出现。第三，不能排除本研究中使用的行为学测试不够敏感，无法观察到性别差异的可能性。
尽管在行为学水平上检测到的性别差异有限，但研究人员通过bulk RNAseq的分析结果，首次揭示了SNI术后2周（小鼠开始表现出轻度抑郁样表型的早期时间点）雌雄小鼠的转录组变化具有显著不同。进一步分析发现，此一表达谱差异揭示了性别特异性及脑区的差异基因特征。在前扣带皮层（ACC）中雌性小鼠表现出比雄性小鼠更强烈的转录组变化，在内侧前额叶皮层（mPFC）中则出现相反的模式。与此同时，GSEA分析发现不同脑区不同性别富集到的信号通路各不相同。然而，SNI后雌性和雄性mPFC髓鞘发育相关基因均出现显着去富集，提示髓鞘发育与功能异常可能参与SNI诱导痛觉增敏及抑郁样行为的机制。同时在雌性ACC中，SNI组轴突及神经突触相关基因集呈现富集化，细胞外基质的基因集在SNI后则出现去富集现象，而雄性ACC中不存在此类特征。此一发现揭示了SNI 2周引发mPFC和ACC转录谱变化的性别依赖性特征，可能是影响SNI诱导神经性疼痛和抑郁共病易感性的关键因素。
总的来说，本研究揭示了SNI诱发疼痛合并抑郁样行为的早期发生发展过程中，mPFC和ACC脑区的基因表达差异，相关结果可能为神经性疼痛诱导抑郁共病的发病机制和易感性的性别差异提供重要理论依据。
该论文的第一作者是博士研究生戴卫平和硕士研究生黄淑颖，通讯作者是叶小菁教授和林伟杰教授。该项工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省自然科学基金、广东省科研项目、广州市科技计划、广东省科技厅、中央高校基本科研基金资助等项目的支持。
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参考文献（上下滑动阅读）
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本文完