Cell Reports︱刘胜/刘奕志团队绘制哺乳类动物视网膜神经节细胞多模态图谱

撰文︱刘   胜

责编︱王思珍

编辑︱杨彬薇

功能、形态和基因特性是神经元的基本属性，从神经元的基因特性到其对应的功能表型和形态表型存在巨大的鸿沟，鉴定神经元的基因型对应的功能表型和形态表型也是重大难题，但却对理解大脑工作的神经基础至关重要。

近年来，高通量的单细胞测序技术的出现和发展，推动了神经元分类研究，发现了众多新的神经元类型，绘制了基于基因表达分类的复杂的“大脑地图”，使我们更深刻地理解大脑的构成。然而，高通量的单细胞测序技术的不足之处是该技术只能获取细胞的转录组信息，而神经元对应的电生理功能、形态和位置信息不清楚。全细胞电生理膜片钳联合单细胞测序技术（Patch-seq）是最近发展出来的一个前沿的神经科学技术，能精确地同时获取单个神经元精确的位置、形态特征、电生理学特性和基因表达特性，同时获取神经元全面的多模态信息不仅对于深刻地理解大脑的工作原理至关重要，也会为疾病的研究打下重要的基础。

2022年9月13日，中山大学中山眼科中心刘胜/刘奕志团队在Cell子刊Cell Reports（影响因子10.99）在线发表题为“Linking transcriptomes with morphological and functional phenotypes in mammalian retinal ganglion cells”的文章。研究人员改进和优化了Patch-seq技术，能同时获取视网膜神经节细胞的光反应、形态和基因表达多模态信息，绘制了视网膜神经节细胞的多模态图谱，从分子、功能和形态多个维度解析了不同亚型的视网膜神经节细胞的细微差别，这对理解视觉信息加工处理的神经基础甚为重要，有助于了解受青光眼和视神经损伤等疾病影响的细胞类型的多模态信息，发现新的精确治疗方法。（拓展阅读：刘胜/刘奕志团队最新研究成果，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：Nat Neurosci︱刘胜/刘奕志/向孟清团队研究证实成年灵长类存在活跃的神经发生现象）

以往Patch-seq技术主要运用在脑片和培养细胞的研究中，只能获取神经元的电生理特性，不能获取其功能特性。视网膜神经细胞在离体的情况下，仍然可以很好地保持其光反应特性，可以获取神经元的功能特性，能更好地研究神经元基因特性和功能表型的关系。本研究把Patch-seq技术运用到视网膜研究中，根据视网膜组织的特点，对Patch-seq技术进行了优化和改进，从而能同时获取视网膜神经节细胞的光反应、形态和基因表达多模态信息。

视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cells，RGCs）是唯一连接大脑并将视网膜信息从眼睛传递到大脑的神经元，它对外界的视觉信息进行了初步整合，再传入大脑，是视觉信息通往大脑的入口。青光眼和视神经损伤，主要表现为RGCs的进行性凋亡，RGCs多模态图谱有助于了解受青光眼和视神经损伤等疾病影响的细胞类型的多纬度信息，有助于寻找精准治疗方案，具有重要的临床意义。

使用Patch-seq技术，研究人员分析了具有转录组信息的472个RGCs（图1 A），其中有144个细胞成功地重构其完整的形态（图1 B），通过机器学习算法映射到基于转录组的小鼠视网膜细胞分类图上[1]，可分为43个细胞类型。依据形态层级分类规则[2]，具有完整形态的144个细胞可分到18个形态类型。研究人员将高精度的Patch-seq技术和高通量的单细胞测序技术相结合，绘制的RGCs三维模态图谱具有重要的价值。这个图谱就像一张“地图”，可以帮助科研人员迅速了解RGCs的不同亚类对应的光反应特性和形态特征和分子特征，这些数字化特征可更好地量化构成视网膜不同亚型的RGCs的细微差别，了解不同亚型的RGCs如何构成从而支持视觉信息的加工和处理，推动视觉的细胞和分子基础研究，为青光眼和视神经损伤研究提供基础性的资源和工具，更好地精确研究眼科疾病影响的RGCs亚型，并提供功能、形态和分子的完整信息，推动精准治疗的发展。

图1  Patch-seq RGCs转录组与形态分类

（图源：Huang W. et al., Cell Reports, 2022）

多模态图谱不仅为已发现的基于基因表达的细胞类型对功能和形态的推测提供直接的验证，也为新发现的细胞类型提供功能和形态的注释。Alpha（ɑ）神经节细胞是一种已被深入研究的节细胞类型，它们最为典型的形态特征是大的细胞体，粗壮的树突和轴突，大而且是单分层的树突。在该研究中发现比对到C42_AlphaOFFS、C45_AlphaOFFT的RGCs光反应分别表现为持续型、瞬时型的撤光反应，其重构的形态表现为胞体大、树突粗壮且树突呈单层分布于内从状层外部；比对到C43_AlphaONS、C41_AlphaONT的RGCs光反应分别表现持续型、瞬时型的给光反应，树突呈单层分布于内从状层内部。另一类ON-OFF方向选择性节细胞是一类树突双分层、对给光/撤光反应均有动作电位发放且对特定方向有偏好的细胞。C16_ooDS_DV在Tran et al., 2019被推测属于ON-OFF方向选择性节细胞家族，该研究中发现推测为C16_ooDS_DV的细胞，其光反应恰好为ON-OFF且具有方向选择性（图2），形态上，该RGCs属于37*型[2]，表现为树突具有明显的双分层且分别与位于GCL层和INL层的星爆无长突细胞的树突重合，这些都是ON-OFF方向选择性RGCs的特点。

图2  转录组属于C16_ooDS_DV的Patch-seq RGCs的光反应和形态

（图源：Huang W. et al., Cell Reports, 2022）

本研究为19种Novel的转录组类型提供了形态和功能注释。例如，对于转录组归属到名为C10_Novel的细胞（图3 A），该研究发现都是呈现ON反应，且形态均归属于7i/7o类型。这些细胞都具有树突面积较大、树突在内丛状层呈现单分层且与位于GCL层的星爆无长突细胞的分支重合的特点。如转录组归属到名为C39_Novel的细胞（图3 B），在形态上归属于5si类型，具有树突面积较小但复杂度较高、分支点较多的特点，其树突广泛分布于内丛状层的中间，提示这类细胞可能参与加工高分辨率图像；而在功能上，这部分细胞呈现出在蓝光下为ON-OFF、在绿光下为ON的颜色选择性特点。C39_Novel的这些特点提示其可能参与了高分辨率的视觉形成。再如转录组归属到C34_Novel的细胞（图3 C），虽然形态上树突也分布在内丛状层中层附近，但功能上却都呈现为ON反应。

图3  转录组属于C10_Novel、C39_Novel以及C34_Novel的Patch-seq RGCs的光反应和形态

（图源：Huang W. et al., Cell Reports, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究优化和改进了Patch-seq技术，使之可以从单个视网膜神经节细胞（RGCs）中同时获取转录组、形态和功能信息，绘制了RGCs的多模态图谱，从分子、功能和形态多个维度解析了不同亚型的RGCs的细微差别，该图谱的建立有助于早期视觉信息处理加工的细胞和分子机制研究，有助于对视网膜神经病变的精确治疗方法研究。该研究仍有一些不足之处，比如，由于Patch-seq技术难度大，通量低，该研究没有做到覆盖所有的转录组类型。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111322

中山大学中山眼科中心、眼科学国家重点实验室为第一单位，中山大学中山眼科中心的黄婉静、许强、粟静、唐磊、郝赵哲为本论文共同第一作者，中山大学中山眼科中心的刘胜研究员、刘奕志教授和刘峰博士为本文共同通讯作者。

中山大学中山眼科中心

（图片提供自：中山大学中山眼科中心刘胜/刘奕志团队）

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Tran NM, Shekhar K, Whitney IE, Jacobi A, Benhar I, Hong G, Yan W, Adiconis X, Arnold ME, Lee JM, Levin JZ, Lin D, Wang C, Lieber CM, Regev A, He Z, Sanes JR. Single-Cell Profiles of Retinal Ganglion Cells Differing in Resilience to Injury Reveal Neuroprotective Genes. Neuron. 2019 Dec 18;104(6):1039-1055.e12. doi: 10.1016/j.neuron.2019.11.006.

[2] Bae JA, Mu S, Kim JS, Turner NL, Tartavull I, Kemnitz N, Jordan CS, Norton AD, Silversmith WM, Prentki R, Sorek M, David C, Jones DL, Bland D, Sterling ALR, Park J, Briggman KL, Seung HS; Eyewirers. Digital Museum of Retinal Ganglion Cells with Dense Anatomy and Physiology. Cell. 2018 May 17;173(5):1293-1306.e19.

本文完