PloS Genet︱邢玲燕/吴刘成/孙俊杰合作揭示脊髓性肌萎缩症运动神经元非细胞自主变性新机制

撰文︱孙俊杰

责编︱王思珍

编辑︱杨彬薇

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是儿童常见的致死性遗传疾病，最主要的病理特征是脊髓前角的运动神经元变性和神经肌肉接头坏死。SMA由运动神经元存活1基因（SMN1）的突变或缺失不能编码SMN蛋白引起。人类还存在一至数个拷贝的SMN1的备份基因，称为运动神经元存活2（SMN2），由于错误剪接仅能产生少量的功能性SMN蛋白，但这不能弥补SMN1的缺失[1]。直接补充SMN蛋白或校正SMN2的剪接是治疗SMA的主要方法。

SMN是一种功能多样的管家蛋白。其最广为人知的功能是与Gemin蛋白形成复合物以参与剪接体组装。SMN的另一个重要功能是参与运动神经元轴突中的信使RNA转运。然而，迄今为止，还没有发现由于剪接错误或改变定位而导致运动神经元死亡的SMN下游分子。

研究表明SMA中运动神经元并不是细胞自主缺陷，有三个重要证据：1）在健康的运动神经元中特异性删除SMN只能引起有限的运动障碍而不是完全的SMA；2）向SMA的运动神经元中特异性补充SMN不能完全缓解病情；3）在非神经元细胞中挽救SMN的表达能够缓解SMA病情并极大地延长寿命[2-4]。然而，究竟是何原因导致SMA运动神经元非细胞自主病变尚不清楚。一个重要的限制是缺乏相应的资源以揭示在SMA发病过程中哪些细胞类型发生改变以及如何改变。

2022年9月8日，南通大学神经再生重点实验室孙俊杰/邢玲燕和南通大学实验动物中心吴刘成在PloS Genetics杂志发表了题为“Single-cell RNA sequencing reveals dysregulation of spinal cord cell types in a severe spinal muscular atrophy mouse model”的研究。该研究建立了严重型SMA小鼠脊髓的单细胞图谱，发现了一个血管成纤维细胞亚群在SMA中显著减少，并由此揭示了SMA小鼠血管缺陷和输氧能力降低造成脊髓细胞普遍缺氧最终导致运动神经元变性的新机制。

该研究使用出生后4天的严重型SMA小鼠（Smn^–/–, SMN2^2tg/0）进行单细胞测序，该小鼠寿命约为10天，出生后4天被认为是病情恶化的转折期。同窝的杂合子小鼠作为对照（Smn^+/–, SMN2^2tg/0）。经过10xGenetics测序和质控过滤，8887个对照细胞和13268个SMA细胞被用于后续分析。经过降维，细胞被划分成16个簇。根据已知的标志物基因，它们被定义为10个细胞类型，分别是：星形胶质细胞（astrocyte）、小胶质细胞（microglia）、少突胶质前体细胞（OPC、COP）、少突胶质细胞（OL）、神经元（neuron）、室管膜细胞（ependymal）、脉管系统（vasculature）、血细胞（blood）以及雪旺细胞（Schwann cell）（图1A, B）。其中细胞数目最多的是OPC和astrocyte，细胞数目最少的是神经元（图1C）。

图1 识别细胞类型

（图源：Junjie Sun, et al., PloS Genet, 2022）

作者接下来解析了几个关键细胞类型的亚群。Astrocyte、ependymal、microglia和vasculature分别被降维成5个、2个、6个、11个、5个亚群（图2A-E）。根据标志物基因的功能，5个vasculature亚群（Vas 0-4）分别被定义为内皮细胞、周细胞、成纤维细胞、成纤维细胞和内皮细胞。作者分析了SMA小鼠每种细胞亚型的差异表达基因（DEG）。DEG数目最多的是一个血管成纤维细胞亚群Vas-2，这意味着该群可能是SMA小鼠脊髓中缺陷最严重的细胞亚型（图2F）。

以上数据只得到了有限挖掘，因此作者开发了一个可视化界面，用户可直接访问细胞类型或者亚型的数据并快速检索感兴趣的基因。访问地址：https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell/study/SCP1933/single-cell-transcriptomics-of-the-spinal-cord-of-a-severe-sma-mouse#study-visualize.

图2 识别细胞亚型和它们的DEG

（图源：Junjie Sun, et al., PloS Genet, 2022）

作者详细分析了各个细胞类型（亚型）在SMA中的改变，也讨论了它们在SMA发病过程中的潜在作用，其中DEG数目最多的成纤维细胞尤其受关注。在SMA中，一个成纤维细胞亚群Vas-2的数目几乎耗竭，而另一种成纤维亚群Vas-3的数目变化不大（图3A, B）。Vas-2亚群差异表达变化倍数TOP5的基因是Col3a1、Col1a1、Rarres2、Dcn和Fn1，它们都是成纤维细胞标志物基因（图3C-E）。Vas-2和Vas-3的差异表达基因仅少量重叠（图3F），说明SMN减少对同一类细胞不同亚型的影响并不相同，即有选择性。

作者使用-免疫荧光染色验证了这一重要发现。Pecam1/CD31被用于标记血管内皮细胞，Col3a1被用于标记成纤维细胞。结果显示，CD31和Col3a1几乎100% 共定位，表明血管内皮细胞和成纤维细胞以空间和功能相关的方式共存，这与成纤维细胞作为血管支持细胞的潜在作用一致。值得注意的是，随着SMA脊髓中CD31的减少，Col3a1的表达也显着降低（图3G, H），这与单细胞测序的数据一致，也表明Vas-2成纤维细胞缺乏可能作为支持细胞导致了SMA小鼠的血管缺陷。

血管结构缺陷已经在SMA病人和小鼠中被报道[5,6]，该研究进一步指出血管缺陷来自于成纤维细胞亚群的缺乏。为揭示血管缺陷对脊髓其他细胞类型的影响，作者分析了能量代谢和蛋白合成相关通路在SMA中的变化。结果与预想一致，ATP metabolic process和translation通路在包括神经元在内的各个细胞类型中广泛下调，这可能是血管缺陷引起的缺氧造成的（图3I）。

图3 SMA小鼠脊髓血管成纤维细胞亚群显著减少

（图源：Junjie Sun, et al., PloS Genet, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究使用单细胞测序鉴定并解析了严重型脊髓性肌萎缩症（SMA）小鼠脊髓的细胞类型、亚型及其DEG并构建了可视化界面，为本领域提供了一个有用的资源。基于该资源，作者发现一个血管成纤维细胞亚群的减少是SMA小鼠脊髓单细胞水平最为显著的改变，成纤维细胞的缺乏可能作为支持细胞造成了血管的结构缺陷。SMA中细胞间通讯的减少和能量代谢、蛋白质合成通路的普遍下调也表明异常的血管结构可能减少了整个脊髓的物质交换，进而引发运动神经元变性。

尽管成纤维细胞是脉管系统的重要组成部分，但对其精确功能的研究还不多。有趣的是，近期有研究指出成纤维细胞在神经退行性疾病中扮演着支持细胞以外的角色[7-9]。这暗示着成纤维细胞可能具有未知的重要功能，其病变可能是神经退行性疾病的一个典型特征。为什么在SMA以及其他神经退行性疾病中成纤维细胞更易受到-损伤也值得将来探索。

总之，该研究不仅提供了第一个SMA的单细胞图谱，也揭示了一种运动神经元细胞非自主变性新机制。

原文链接：https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010392

南通大学神经再生重点实验室孙俊杰和南通大学附属妇幼保健院仇嘉颖为该文的第一作者。南通大学神经再生重点实验室孙俊杰、邢玲燕和南通大学实验动物中心吴刘成是该论文的通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金和南通市科技局指令性项目的支持。

第一并共同通讯作者孙俊杰（左一），第一作者仇嘉颖（左二），通讯作者吴刘成（右二），通讯作者邢玲燕（右一）

（照片提供自：孙俊杰/吴刘成/邢玲燕团队）

往期文章精选
【1】Neuron︱突触内发动蛋白调控超快内吞方式的新分子机制【2】JNNP︱邱伟/余青芬团队在发现家族性视神经脊髓炎谱系疾病易感基因【3】Nat Neurosci︱突破！大脑电刺激可持续改善老年人的工作和长期记忆【4】Nat Methods︱张阳团队发布蛋白质/核酸及其复合物的通用结构比对算法：US-align【5】J Neuroinflammation 综述︱新冠肺炎与认知障碍：神经侵袭性和血脑屏障功能障碍【6】CRPS 综述︱沈国震团队评述光电人工突触器件研究进展【7】Science | 灵长类背外侧前额叶皮质分子和细胞水平的进化图谱【8】BMC Medicine︱宋欢/索晨团队发现精神疾病遗传易感性与COVID-19感染风险相关【9】Mol Neurobiology︱杨莉/龙程课题组揭示小胶质细胞介导慢性应激所致焦虑行为的分子通路【10】Nat Commun︱叶克强团队发现TrkB激动剂前药-R13可抑制骨流失优质科研培训课程推荐【1】R语言临床预测生物医学统计专题培训（10月15-16日，北京·中科院遗传与发育生物学研究所）会议/论坛预告【1】预告 | 神经调节与脑机接口会议（北京时间10月13-14日（U.S. Pacific Time：10月12-13日）欢迎加入“逻辑神经科学”【1】人才招聘︱“ 逻辑神经科学 ”诚聘文章解读/撰写岗位 ( 网络兼职, 在线办公)
参考文献（上下滑动阅读） 

[1] C.L. Lorson, E. Hahnen, E.J. Androphy, and B. Wirth, A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A 96 (1999) 6307-11.

[2] G.H. Park, Y. Maeno-Hikichi, T. Awano, L.T. Landmesser, and U.R. Monani, Reduced survival of motor neuron (SMN) protein in motor neuronal progenitors functions cell autonomously to cause spinal muscular atrophy in model mice expressing the human centromeric (SMN2) gene. J Neurosci 30 (2010) 12005-19.

[3] R.G. Gogliotti, K.A. Quinlan, C.B. Barlow, C.R. Heier, C.J. Heckman, and C.J. Didonato, Motor neuron rescue in spinal muscular atrophy mice demonstrates that sensory-motor defects are a consequence, not a cause, of motor neuron dysfunction. J Neurosci 32 (2012) 3818-29.

[4] Y. Hua, Y.H. Liu, K. Sahashi, F. Rigo, C.F. Bennett, and A.R. Krainer, Motor neuron cell-nonautonomous rescue of spinal muscular atrophy phenotypes in mild and severe transgenic mouse models. Genes Dev 29 (2015) 288-97.

[5] E. Somers, R.D. Lees, K. Hoban, J.N. Sleigh, H. Zhou, F. Muntoni, K. Talbot, T.H. Gillingwater, and S.H. Parson, Vascular Defects and Spinal Cord Hypoxia in Spinal Muscular Atrophy. Ann Neurol 79 (2016) 217-30.

[6] A. Araujo, M. Araujo, and K.J. Swoboda, Vascular perfusion abnormalities in infants with spinal muscular atrophy. J Pediatr 155 (2009) 292-4.

[7] Yang AC, Vest RT, Kern F, Lee DP, Agam M, Maat CA, et al. A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer’s risk. Nature. 2022; 603(7903):885–92. Epub 2022/02/16.

[8] Manberg A, Skene N, Sanders F, Trusohamn M, Remnestal J, Szczepinska A, et al. Altered perivascular fibroblast activity precedes ALS disease onset. Nat Med. 2021; 27(4):640–6. Epub 2021/04/17.

[9] C.E. Dorrier, H.E. Jones, L. Pintaric, J.A. Siegenthaler, and R. Daneman, Emerging roles for CNS fibroblasts in health, injury and disease. Nat Rev Neurosci 23 (2022) 23-34.

本文完