Neuron︱突触内发动蛋白调控超快内吞方式的新分子机制

撰文︱王亚龙

责编︱王思珍

编辑︱杨彬薇

神经元持续的神经活动需要大量的突触囊泡参与，而胞体无法及时补充消耗的囊泡，因此突触内形成多种囊泡循环方式以保证突触囊泡的膜和蛋白成分的快速回收，以便重复利用[1]。以往的研究表明，网格蛋白介导胞吞途径（clathrin mediated endocytosis，CME）是突触内囊泡成分回收的主要方式[2]，但近些年报道的超快胞吞方式（ultrafast endocytosis）越来越引起人们的兴趣[3,4]。发动蛋白1（Dynamin 1，Dyn1）是一种参与多种胞吞途径的重要蛋白，在囊泡与突触前膜分离（fission）过程中发挥GTPase活性[5]。然而，Dyn1从细胞质募集到细胞膜上的胞吞位点往往需要较长的时间（10-30 s）[6]，而超快胞吞方式却可以在生理温度下在50-300 ms内完成[3,4]。因此，这种在时间尺度上的差异引起了科学家们的兴趣。

近日，来自霍普金斯大学细胞生物中心的Shigeki Watanabe教授课题组联合德国夏瑞蒂医科大学的Christian Rosenmund教授课题组共同在Neuron上发表了标题为“Dynamin is primed at endocytic sites for ultrafast endocytosis”的研究论文，揭示了突触内dyn1蛋白能够提前在胞吞位点聚集形成Dyn1富集区，从而快速启动超快胞吞方式，使之在100 ms内完成。他们报道了Dyn1A是超快胞吞方式中发挥作用的主要Dyn1亚型，通过与另一种胞吞蛋白Syndapin 1相互作用在细胞膜上形成生物分子致密物（molecular condensates）。而通过点突变阻断其相互作用，这种分子致密物不再形成，并且超快胞吞方式减慢了约100倍。因此，Syndapin 1 蛋白作为一个衔接蛋白，将Dyn1A富集并且锚定在细胞膜上的胞吞位点上，通过这种方式跳过了常规的蛋白募集的限速步骤，从而加快了突触内的胞吞速率。

Dyn1参与超快胞吞方式在之前的研究中早有报道[4]。首先为了检测Dyn1是如何调节超快胞吞方式的，作者应用了“flash-and-freeze”的方法检测培养的神经元突触中囊泡的形态变化（图1）。Dyn1/3都是神经系统中富集的dyn类型，但是将Dyn3敲除后，并未引起突触功能和结构上的明显改变，外源摄入的铁蛋白在1 s（检测超快胞吞方式）时出现在大的内吞结构（large endocytic vesicles，LEVs）中以及在10 s（检测囊泡从LEVs上生成）时出现在突触囊泡中（图1A&B）。而同时敲除Dyn1/3后，内吞结构滞留在活性区（active zone）旁侧的细胞膜上，并且没有铁蛋白颗粒出现在LEVs和突触囊泡内（图1C&D）。这些结果表明同时敲除Dyn1/3后超快胞吞方式被阻断（图1A-D）。Dyn1A/1B是dyn1的两种亚型，它们在结构上的差异表现为，Dyn1A的C端有两段额外的SH3结合模块。在本研究中，当重新表达Dyn1A蛋白后能够挽救上述所有的表现型，而Dyn1B并未发挥作用（图1E-H），这些结果进一步说明超快胞吞方式主要是通过Dyn1亚型介导的（图1）。

图1. Dyn1A亚型介导了快速胞吞方式。

（图源：Imoto Y et al., Neuron, 2022）

既然从微观结构上明确了Dyn1A参与快速胞吞方式的进行，那么Dyn1A在突触内如何分布的呢？作者在原代培养的海马神经元中过表达Dyn1A/B-GFP，以Synaptobrevin 2（Syb2）作为突触前标志物，然后在共聚焦显微镜下观察发现，相比于Dyn1B，更多的Dyn1A信号分布在突触前（51.1% vs 22.4%），而Dyn1B更多的是弥散分布在整个轴突（图2A-C）。并且通过定位Dyn1A和Syb2信号的峰值分布，发现Dyn1A信号主要聚集分布在活性区的附近（<100 nm）（图2E-F）。采用CRISPR/Cas9实现Dyn1A/B-GFP敲入的方法可以消除过表达产生的非特异性，超高分辨率的STED显微镜也得到了类似的结果（图2G-L）。不仅如此，通过使用一种弱去垢剂Digitonin，增大细胞膜的通透性使得细胞质内的小分子能够扩散出细胞而留住细胞内的细胞器组分，结果发现Dyn1A信号强度虽然降低了大约40%，但是信号斑点（puncta）依旧分布在Syb2附近，而表达于胞浆中的tdTomato信号很快就被洗掉（图2M-O），表明Dyn1A信号依附在细胞膜上。相似的结果在活的神经元中也有观察到。综合表明Dyn1A蛋白提前聚集在细胞膜上的胞吞区域。

图2. Dyn1A亚型富集在突触前结构。

（图源：Imoto Y et al., Neuron, 2022）

接着作者应用活细胞成像技术和FRAP技术，检查了过表达Dyn1A-GFP神经元突触Dyn1A puncta信号的行为方式。结果发现，轴突上淬灭的Dyn1A荧光信号能够快速恢复；而将整个突触的Dyn1A信号淬灭，其荧光信号的恢复明显变慢（图3 A-D），表明突触Dyn1A puncta具有潜在的液滴状态，并提示Dyn1A可能能够形成生物分子致密物（molecular condensates）。类似的结果在COS-7活细胞中也被观察到。为了进一步探索Dyn1A的活动是否存在相分离（phase separation）的特征，作者采用了多种脂肪醇打断弱疏水结合，发现Dyn1A信号在30-60 s内沿轴突成弥散状态，而对照组中Dyn1A信号可以保持稳定状态超过60 s（图3 E&F），表明Dyn1A信号在突触内确实存在相分离的特征。同时，后续实验也进一步表明，Dyn1A puncta呈现液滴状，且其中一小部分Dyn1A分子可能与puncta内的蛋白质或膜结合。

图3. Dyn1A在突触前分布有相分离的特征。

（图源：Imoto Y et al., Neuron, 2022）

多种胞吞蛋白，如Dyn1参与胞吞作用依赖其磷酸化和去磷酸的修饰状态。GSK3b和CDK5可以分别在Dyn1的脯氨酸富集模块（proline-rich motif）S774和S778位点进行磷酸化修饰；而Calcineurin可以在Dyn1的S774/S778位点进行去磷酸化，增加Dyn1和另一种胞吞蛋白Syndapin 1之间的相互作用[7]。为了证明Dyn1的磷酸化或去磷酸化状态是否参与对Dyn1A的相分离调节，作者构建了两种突变型Dyn1A ：持续被磷酸化的Dyn1A S774/778D，以及无法被磷酸化（即保持去磷酸化）的Dyn1A S774/778A。将突变体Dyn1A表达在神经元中观察其在突触中的分布。发现，去磷酸化类型Dyn1A S774/778A的总的荧光水平以及分布和WT神经元一致，而磷酸化类型的Dyn1A S774/778D的信号更加弥散，且广泛地分布在轴突上，信号puncta的荧光强度也显著降低（图4）。表明Dyn1A在突触前的富集形成信号puncta依赖于Dyn1A的去磷酸化。

图4. dyn1A脯氨酸富集模块的去磷酸化对于相分离是必需的。

（图源：Imoto Y et al., Neuron, 2022）

那么，Dyn1A是如何聚集在细胞膜上活性区域旁的呢？Syndapin 1是Dyn1A的重要相互作用蛋白，其通过SH3结构域与Dyn1A的脯氨酸富集模块结合，同时Syndapin 1含有的BAR结构域又能够与细胞膜结合[8]。为了探索Syndapin 1是否也参与Dyn1A puncta在突触前的富集，作者首先在神经元中进行Syndapin 1进行了敲低。在Syndapin 1敲低的神经元中，不仅Dyn1A信号开始沿轴突弥散分布，剩余在突触内的Dyn1A puncta信号强度也显著变弱。不仅如此，在透射电镜下，突触对铁蛋白的内吞被明显减慢，囊泡从LEVs上的生成也被阻断。重新表达野生型的Syndapin 1能够挽救这些表现型，而不能与细胞膜结合的Syndapin 1 ID/ME，以及不能与Dyn1A结合的Syndapin 1 P434L均不能挽救这些表现型，表明了Syndapin 1很可能作为重要的核心蛋白，在胞吞发生前将Dyn1A富集到活性区域旁的胞吞位点，从而大大加速了胞吞的进程。

图5. Syndapin 1对超快胞吞方式的进行是必需的。电镜图左侧为未刺激对照组，中间为刺激1 s后，右侧为刺激10 s后。

（图源：Imoto Y et al., Neuron, 2022）

图6.  图解CME和超快胞吞方式之间时间尺度上的差异。

（图源：Imoto Y et al., Neuron, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综合上述一系列的实验结果，作者提出一个合理的假说来解释不同类型胞吞途径在时间尺度上的差异问题（图6）。网格蛋白介导胞吞途径（CME）中，发动蛋白（Dynamin）以及其他胞吞蛋白需要从细胞质中募集，这个过程往往比较缓慢，需要十多秒甚至是几十秒；但对于超快胞吞方式，Dyn1A蛋白被提前富集在突触前，形成Dyn1A蛋白puncta，这种puncta的维持依赖于Dyn1A的脯氨酸富集模块与Syndapin 1的SH3模块的相互作用，并且将Dyn1A puncta锚定在活性区域旁的细胞膜上。而一系列的突变或者药物处理打断它们之间的相互作用会阻断这种富集状态，使得蛋白需要重新从细胞质募集，最终大大减慢了胞吞的速率。

该文章通过一系列的工作，从多个角度阐述超快胞吞方式工作机制：Dyn1A蛋白提前在胞吞位点聚集形成Dyn1A富集区，从而大大快速了超快胞吞方式（图6）。该理论的提出为囊泡循环中不同囊泡回收方式时间尺度差异的解释提供了重要线索。然而，以往文献报道超快胞吞方式只能在生理温度下进行，而CME也被认为主要是在室温条件下进行。所以，不同温度对于超快胞吞方式等胞吞途径的调控也是一个相当有趣的话题，或许会成为下一个论证的热点。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.06.010

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Chanaday N L, Cousin M A, Milosevic I, et al. The Synaptic Vesicle Cycle Revisited: New Insights into the Modes and Mechanisms[J]. J Neurosci, 2019, 39(42): 8209-8216.

[2] Granseth B, Odermatt B, Royle S J, et al. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses[J]. Neuron, 2006, 51(6): 773-86.

[3] Watanabe S, Liu Q, Davis M W, et al. Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions[J]. Elife, 2013, 2: e00723.

[4] Watanabe S, Rost B R, Camacho-Perez M, et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses[J]. Nature, 2013, 504(7479): 242-247.

[5] Praefcke G J, McMahon H T. The dynamin superfamily: universal membrane tubulation and fission molecules?[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2004, 5(2): 133-47.

[6] Taylor M J, Perrais D, Merrifield C J. A high precision survey of the molecular dynamics of mammalian clathrin-mediated endocytosis[J]. PLoS Biol, 2011, 9(3): e1000604.

[7] Anggono V, Smillie K J, Graham M E, et al. Syndapin I is the phosphorylation-regulated dynamin I partner in synaptic vesicle endocytosis[J]. Nat Neurosci, 2006, 9(6): 752-60.

[8] Dharmalingam E, Haeckel A, Pinyol R, et al. F-BAR proteins of the syndapin family shape the plasma membrane and are crucial for neuromorphogenesis[J]. J Neurosci, 2009, 29(42): 13315-27.

本文完