Mol Neurobioloby︱杨莉/龙程课题组揭示小胶质细胞介导慢性应激所致焦虑行为的分子通路

撰文︱杨  莉

责编︱王思珍

编辑︱杨彬薇

压力（stress）诱发的脑内炎症被认为是一些精神疾病的一个核心病因。焦虑症（anxiety）在精神疾病中最为常见，已成为现代人的“常见病”。压力导致大脑小胶质细胞（microglia）的过度激活和促炎症因子的释放[1,2]。然而，尚不清楚压力所致的小胶质细胞激活后：1）内侧前额叶-海马（mPFC-HIPP）这一介导焦虑的重要环路的分子及电活动有什么改变；2）抑制小胶质细胞的激活能否改善压力引起的mPFC-HIPP环路的异常以及焦虑行为。

2022年9月1日，广州大学生命科学学院基因编辑工程中心的杨莉课题组和华南师范大学生命科学学院的龙程课题组合作在Molecular Neurobiology上发表了题为“Minocycline offers neuroprotection by ameliorating chronic unpredictable mild stress-induced neuroinflammation and mPFC-HIPP oscillatory activity in mice”的研究论文。Sidra Tabassum、Afzal Misrani和霍清伟为论文共同第一作者，龙程教授和杨莉教授为论文共同通讯作者。在此项研究中，作者发现，对C57小鼠实施为期三周的慢性不可预见的轻度压力（chronic unpredictable mild stress，CUMS），在引起焦虑行为及mPFC和HIPP小胶质细胞过度激活的同时，升高了促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNFα、ROS介导的氧化应激和线粒体裂解蛋白Drp-1水平，降低了ATP合成、烟碱型乙酰胆碱能α7受体（nAChRα7）、保护细胞的Nrf-2、GABA信号通路关键蛋白（GS、Vgat、GABAα1R）的水平。在神经环路水平，CUMS导致HIPP局部场电位β和γ震荡升高，mPFC-HIPP环路同步化异常。进一步的实验表明，CUMS造成的小胶质细胞过度激活是导致上述异常的关键因素，因为腹腔注射能阻止小胶质细胞激活的米洛环素改善了上述蛋白表达、环路及行为异常。该文从分子、细胞和神经环路水平丰富了对小胶质细胞激活及其炎症介导焦虑行为的认知。（拓展阅读：杨莉课题组往期进展，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：MN︱杨莉课题组揭示阿尔茨海默症早期嗅觉异常的新机制: 增强GABA信号通路改善嗅球伽马振荡异常）

21天的CUMS后，新环境摄食抑制实验（NSF）及情境焦虑测试（contextual anxiety）结果显示，CUMS小鼠的摄食延迟时间（图1C）、静止（F）和僵立反应（G）增加，说明CUMS导致小鼠的焦虑行为。有趣的是，在CUMS的第14到21天腹腔注射米诺环素（Mino）抑制小胶质细胞激活，阻止了CUMS产生上述异常行为。

图1. CUMS导致焦虑行为，米诺环素阻止焦虑发生

（图源S Tabassum, et al.,Mol. Neurobiology, 2022）

精神疾病发生伴随小胶质细胞的激活，而胶质细胞产生炎症细胞因子[3,4]。因此，作者采用免疫细胞化学方法（iba1染色）发现CUMS确实激活了mPFC（图2B-E）和HIPP（图3B-E）的小胶质细胞。进而，免疫印迹测试(Western blot）检测到CUMS鼠的mPFC（图2F-H）和HIPP（图3F-H）的炎性细胞因子升高。已有的研究报道了nAChRα7在小胶质细胞参与的炎症反应中起重要作用[5,6]，本研究的结果也发现nAChRα7受体水平在CUMS鼠的mPFC（图2I-J）和HIPP（图3I-J）都降低。这些实验结果表明，CUMS升高了mPFC和HIPP促炎性细胞因子水平、降低了胆碱能nAChRα7受体水平；用米诺环素抑制小胶质细胞的激活则改善了上述异常。

图2. CUMS增加mPFC小胶质细胞的激活和炎性细胞因子水平，降低nAChRα7水平，米诺环素改善了CUMS效应

（图源S Tabassum, et al.,Mol. Neurobiology, 2022）

图3. CUMS增加HIPP小胶质细胞的激活和炎性细胞因子水平，降低nAChRα7水平，米诺环素改善了CUMS效应

（图源S Tabassum, et al.,Mol. Neurobiology, 2022）

线粒体与能量（ATP）合成、ROS信号通路、神经炎症及焦虑间关系密切[7,8]，作者因而测试了CUMS引起的ATP-5A、Nitrotyrosine、线粒体裂解和融合蛋白变化。免疫印迹结果显示，CUMS升高了mPFC（图4）和HIPP（图5）ROS介导的氧化应激（nitrotyrosine）和线粒体裂解蛋白Drp-1水平，降低了ATP合成。这些实验结果表明，CUMS造成mPFC和HIPP线粒体及其相关功能异常；用米诺环素抑制小胶质细胞的激活改善了上述异常。

图4. CUMS对mPFC线粒体及能量合成等的影响，米诺环素改善了CUMS效应

（图源S Tabassum, et al.,Mol. Neurobiology, 2022）

图5. CUMS对HIPP线粒体及能量合成等的影响，米诺环素改善了CUMS效应

（图源S Tabassum, et al.,Mol. Neurobiology, 2022）

脑区间神经元震荡电位（oscillations）及其功能连接是情绪和认知功能的功能指标[9,10]，作者进而用在体双通道电生理技术同步记录了mPFC和HIPP脑区的局部场电位，发现CUMS升高了HIPP的beta和gamma震荡（图6）。锁相值（phase locking value）是基于相位的功能连接，测量两个通道信号同步程度的方法，结果显示CUMS增强了mPFC和HIPP两个脑区之间的同步程度（图7）。双通道场电位结果提示，CUMS改变了mPFC-HIPP环路的同步化程度。因此，上述分子细胞层面改变引起的mPFC-HIPP环路功能的异常可能是CUMS导致焦虑行为的神经机制；用米诺环素抑制小胶质细胞的激活则改善了mPFC-HIPP环路异常。

图6. CUMS升高了HIPP的beta和高低gamma震荡电位。米诺环素改善了CUMS效应

（图源S Tabassum, et al.,Mol. Neurobiology, 2022）

图7. CUMS升高了mPFC和HIPP间高和低gamma震荡的锁相值，米诺环素改善了CUMS效应

（图源S Tabassum, et al.,Mol. Neurobiology, 2022）

GABA信号通路特别是GABA_AR介导的抑制调控gamma震荡的产生[10,11]，作者因而用免疫印迹法测试了GABA通路相关蛋白的表达。结果显示，CUMS降低了mPFC和HIPP的GABA_Aα1受体、以及与GABA合成有重要作用的谷氨酰胺酶GS和氨基丁酸转运蛋白Vgat水平（图8）。RT-PCR结果显示GABA_Aα1受体mRNA水平降低（图8F, L）。这些结果提示，GABA信号通路蛋白表达异常可能是mPFC-HIPP环路功能异常的直接原因，而促炎性因子、nAChRα7受体及线粒体蛋白表达异常等可能是GABA信号通路蛋白改变的上游因素。

图8. CUMS降低了mPFC和HIPP脑区GABA信号通路的蛋白表达。米诺环素改善了CUMS效应

（图源S Tabassum, et al.,Mol. Neurobiology, 2022）

图9.工作总结图 CUMS导致小鼠焦虑的分子机制及米诺环素作用靶点

（图源S Tabassum, et al., Mol. Neurobiology, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究采用分子生物学、在体电生理学、行为学及药理学等手段，揭示了CUMS导致的小胶质细胞激活和焦虑间的潜在因果关系，提示小胶质细胞激活后的神经炎症和相关的线粒体改变及mPFC-HIPP环路异常可能是焦虑的病理机制之一（图9）。研究为以小胶质细胞为靶点抗炎症治疗焦虑提供重要参考。不足之处主要有两点：1）米诺环素并非小胶质细胞激活的特异性抑制剂，因此实验并不能完全排除米诺环素作用于其他靶点改善焦虑行为的可能；2）没有直接证据表明线粒体蛋白、ATP合成及nAChRα7受体异常与小胶质细胞激活后的炎性反应间有上下线或因果关系，只讨论了它们之间的相关性。

原文链接：https://doi.org/10.1007/s12035-022-03018-8

第一作者Sidra Tabassum（前排左二）,共第一作者Afzal Misrani（前排左一），共第一作者霍清伟（不在图中），通讯作者龙程（前排左四），通讯作者杨莉（前排右四）

（照片提供自：龙程实验室）

作者简介：

1. 龙程，华南师范大学生命科学学院教授，研究兴趣包括神经信号转导、应激、抑郁及焦虑的脑机制及干预，在研项目包括国家自然科学基金（31871170）、广东省自然科学基金项目（2021A1515010804）及广东省重点领域研发计划“脑科学与类脑研究” （2018B030332001）子课题。

2. 杨莉，广州大学生命科学学院基因编辑工程中心教授，主要从事阿茨海默症及情绪的神经生物学机制研究。在研项目包括国家自然科学基金（32170950, 31970915）及广东省重点领域研发计划“脑科学与类脑研究重大专项”（2018B030336001）子课题。

3.  

杨莉和龙程课题组近五年联合发表的代表性论文如下：

1.     Jiang J#, Tang B#, Wang L#, Huo Q#, Tan S#, Misrani A, Han Y, Li H, Hu H, Wang J, Cheng T, Tabassum S, Chen M, Xie W, Long C*, Yang L*. Systemic LPS-induced microglial activation results in increased GABAergic tone: A mechanism of protection against neuroinflammation in the medial prefrontal cortex in mice. Brain, Behavior, and Immunity. 2022; 99: 53-69. IF=19.227

2.     Chen M#, Chen Y#, Huo Q#, Wang L, Tan S, Misrani A, Jiang A, Chen J, Chen S, Zhang J, Tabassum S, Wang J, Chen X, Long C, Yang L*. Enhancing GABAergic signaling ameliorates aberrant gamma oscillation of olfactory bulb in AD mouse models. Molecular Neurodegeneration. 2021; 16: 14.IF=18.907

3.     Feng XY#, Hu HD#, Chen J, Long C, Yang L*, Wang L*. Acute neuroinflammation increases excitability of prefrontal parvalbumin interneurons and their functional recruitment during novel object recognition. Brain, Behavior, and Immunity.2021; 98: 48-58. IF=19.227

4.     Li HD, Li DN, Yang L, Long C*. Deficiency of the CYLD impairs fear memory of mice and disrupts neuronal activity and synaptic transmission in the basolateral amygdala. Front in Cellular Neuroscience. 2021; 15: 740165. IF=6.147

5.      Peng YG, Cai PJ, Hu JH, Jiang JX*; Zhang JJ, Yang L*, Long C*. Altered corticostriatal synchronization associated with compulsive-like behavior in APP/PS1 mice. Experimental Neurology. 2021; 344: 113805. IF=5.620

6.      Han YY, Jin K, Pan QS, Li B, Wu ZQ, Gan L, Yang L*, Long C*. Microglial activation in the dorsal striatum participates in anxiety-like behavior in Cyld knockout mice. Brain, Behavior, and Immunity. 2020; 89: 326-338. IF=19.227

Chen M, Wang J, Jiang J, Zheng X, Justice NJ, Wang K, Ran X, Li Y, Huo Q, Zhang J, Li H, Lu N, Wang Y, Zheng H, Long C, Yang L*. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. eLife. 2017; 6: e20142. IF=8.713

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参考文献（上下滑动阅读） 

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[2] Jiang J, Tang B, Wang L, Huo Q, Tan S, Misrani A, Han Y, Li H, Hu H, Wang J, Cheng T, Tabassum S, Chen M, Xie W, Long C, Yang L (2022) Systemic LPS-induced microglial activation results in increased GABAergic tone: A mechanism of protection against neuroinflammation in the medial prefrontal cortex in mice. Brain, Behavior, and Immunity 99: 53-69. doi:10.1016/j.bbi.2021.09.017

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本文完