NAR︱何成/苏志达团队发现拓扑异构酶IIA能够调控室管膜下区的成体神经发生

撰文︱秦尚尧

责编︱王思珍

编辑︱杨彬伟

拓扑异构酶（Topoisomerase）是一类高度保守并广泛分布的蛋白质，基因定位于染色体17q21-22，分子量为170kD，是核内含量仅次于组蛋白的生物大分子。其主要功能是缓解DNA 链出现的拓扑学张力[1]。在哺乳动物细胞内，起主要作用的是Ⅱ型拓扑异构酶，并且存在拓扑异构酶ⅡA（TOP2a）和拓扑异构酶ⅡB（TOP2b）两种同源异构体，它们的分子结构非常类似，差异主要存在于两者的C-末端。Ⅱ型拓扑异构酶存在于细胞核内，能够参与众多复杂的催化反应，尤其是它们能够催化调控 DNA 双链的断裂和重连，从而改变DNA的拓扑学结构，这对于DNA复制、基因转录、染色体重组和DNA 修复等过程都十分重要[2,3]。有充分的证据表明，TOP2a 对于细胞生物的存活是必不可少的，并且是抗癌和抗菌治疗的关键临床靶标[4]。TOP2a的遗传缺失会导致胚胎发育停滞在4或8细胞阶段，即具有胚胎致死性，表明其在小鼠早期胚胎发生中承担不可替代的作用[5]。除了其酶活性外，TOP2a在基因组转录调节中的作用，特别是在细胞特化和分化过程中的功能，仍未被完全揭示。

成体神经发生（Adult Neurogenesis）在哺乳动物中间显得十分保守，并且在大脑的可塑性调节中起着十分重要的作用。在成年大脑中，神经发生主要发生在两个专门的神经源性壁龛中，即毗邻侧脑室的室管膜下区（SVZ）和海马的齿状回（DG）。依据这些成体神经发生的区域，神经干细胞（NSC）不断产生新的神经元，并在整个生命过程中整合到现有的神经回路中，而且成体神经发生的异常可能导致多种人类疾病，包括认知障碍和神经退行性疾病等。因此，阐明成年中如何调节神经发生的过程对于理解并治疗神经系统疾病至关重要。

在过去的几十年中，SVZ中外在因素和内在因素之间的相互作用已被证明可以调节NSC在成体神经发生中的活动，但潜在的机制仍然在很大程度上未知。基于前人报道的TOP2a可以指导和调节胚胎发育进程的证据，研究人员试图解析中枢神经系统（CNS）（尤其是在成体大脑）中TOP2a的表达模式，并破译其成体神经发生的特定功能。

2022年8月27日，海军军医大学何成、苏志达教授团队成员在生物医学杂志Nucleic Acids Research上发了题为“Topoisomerase IIA in adult NSCs regulates SVZ neurogenesis by transcriptional activation of Usp37”的研究，揭示了TOP2a在体内室管膜下区的分布、作用以及下游的分子调节机制。这项研究找到了一条TOP2a介导成体神经发生的新分子机制，将显著拓展人们对成体大脑中拓扑异构酶功能的理解并具有潜在的临床应用前景。

多项研究表明，TOP2a可以调控胚胎发育的进程。在该项研究中，作者通过免疫组织化学染色检测了从胚胎早期到成年各个阶段的小鼠大脑中TOP2a的表达情况，发现TOP2a的分布从发育、出生后直至成年变得逐渐局限（图1A），最终仅仅定位在主要的神经发生区，比如SVZ和喙侧潜移流（RMS）（图1B-E）。进一步的细胞定位分析，作者发现TOP2a表达在成体神经干细胞（表达Nestin等）及其子代细胞中（表达Ascl1或者 DCX等）,并发现这些细胞处于活跃的增殖状态（图1F,G）。通过长时程BrdU标记法，作者证明TOP2a并不分布于静息的NSCs中（图1I）。并总结了TOP2a在SVZ部位各个细胞亚型中的分布情况，完成了表达图谱的最终确定（图1 H,J）。

图1  TOP2a在发育阶段和成年大脑中的表达模式

（图源：Qin S, et al., Nucleic Acids Res, 2022）

紧接着，利用成体NSCs体外培养的方法（图2A），作者发现利用针对TOP2a的干扰RNA和特异性的抑制剂能有效地阻滞成体NSCs的自我跟新能力，具体表现在体外神经球数目和增殖潜力的下降（图2B-H）。通过体外的抑制实验，作者初步证实了TOP2a对于成体神经发生的必要性。

图2   体外成体神经干细胞的自我更新需要TOP2a的参与

（图源：Qin S, et al., Nucleic Acids Res, 2022）

为了在体内验证TOP2a对成体NSCs的作用，作者建立了针对TOP2a基因的CreER-Loxp条件敲除小鼠模型（图3A），并在mRNA和蛋白水平发现该模型均能有效降低TOP2a的表达（图3B,C）。但是，作者在试图考察该模型对于SVZ成体NSCs的影响时，发现这并不能明显改变其总体的数量（图3D,E）。鉴于TOP2a的表达模式以及活化NSCs所占的比例，研究者进而分别考察该模型对于静息NSCs和活化NSCs的影响，发现敲除TOP2a仅仅降低活化的NSCs的数量（图3F-I）。

图3  体内敲除TOP2a后成体神经干细胞的反应

（图源：Qin S, et al., Nucleic Acids Res, 2022）

为了进一步说明TOP2a的缺失仅仅影响体内活化的成体NSCs，作者又利用浓缩的慢病毒体内注射的方式，干扰SVZ处TOP2a的表达，并发现这能显著抑制此处成体NSCs的增殖活性（图4A-F）。对于SVZ成体神经发生进程来说，静息NSCs活化后将进一步特化为两类主要的中间前体细胞（瞬时扩增前体细胞，TAPs和神经母细胞），两者分别表达特有的分子标志物Ascl1和DCX。利用条件诱导的小鼠模型，作者发现TOP2a缺失显著降低了两种主要前体细胞的数目（图4G-J）。通过图3和图4的结果，作者证明了TOP2a对于SVZ处正常产生神经细胞以及维持成体神经发生的必要作用。

图4  体内敲除TOP2a后细胞增殖和中间前体细胞的反应

（图源：Qin S, et al., Nucleic Acids Res, 2022）

DCX+的前体细胞是SVZ中活化NSCs产生的子代细胞，它们可以通过RMS切线迁移到远端的嗅球（OB），然后从OB的颗粒细胞层 (GCL) 放射状迁移到OB的小球层(GL)，最终分化成为中间神经元并融入嗅球的神经回路。所以，研究者进一步检测了成体 NSCs中TOP2a的条件性敲除是否最终会影响OB的神经发生。作者先利用BrdU标记从SVZ迁移至OB的新生神经元（图5A），并发现TOP2a的敲除会使OB处新生神经元的数目显著降低（图5B-E），这最终导致成熟的OB中间神经元（BrdU+/NeuN+）的数量变化（图5F,G）。除此之外，作者还考察了受TOP2a影响的中间神经元的亚型，通过共染各个中间神经元的Marker, 发现TOP2a敲除主要减少OB处CR+和CB+两类中间神经元（图5H-I）。这一现象说明TOP2a不仅影响着SVZ处神经前体细胞的产生，而且对维持OB处特定类型的神经发生也起着关键作用。

图5 体内敲除TOP2a影响嗅球处的成体神经发生

（图源：Qin S, et al., Nucleic Acids Res, 2022）

为了深入挖掘成体神经发生中TOP2a作用的潜在分子机制，研究者又利用特异性的抑制剂（PluriSin#2）下调成体NSCs中TOP2a的表达，从而进行了RNA-Seq的分析（图6A, B）。通过差异表达分析、基因功能注释和通路分析等，作者发现与对照组相比，处理组能明显抑制成体NSCs的细胞周期活性、转录活动以及干细胞相关基因的表达等，并且能促进分化相关基因的表达（图6C-F）。这些数据初步提供了TOP2a在成体NSCs增殖过程中起关键作用的分子证据，说明TOP2a下调不利于维持其干细胞特性。

图6  抑制TOP2a后成体NSCs中转录组学的改变

（图源：Qin S, et al., Nucleic Acids Res, 2022）

为了鉴定成体NSCs中可能的TOP2a靶基因，作者还使用TOP2a的C末端结构域特异性抗体进行基因组ChIP-Seq分析（图7），这可以区分其同源异构分子TOP2b的结合区域。通过结合位点分析，作者发现与TOP2a结合的基因主要与Notch、Wnt、海马信号通路等相关，并主要定位于基因的内含子、基因间和启动子区域（图7A-C）。通过De novo Motif分析，作者筛选出了两个干细胞功能相关的、能与转录因子结合的Motif，涵盖的转录因子包括Tcf12、Ascl1、Sox2和Sox3等，表明TOP2a可能以转录依赖的方式调节NSCs的活性（图7D,E）。接着，作者通过RNA-Seq和ChIP-Seq整合分析的方法找出了8个候选的TOP2a直接作用的靶基因，其中Usp37， Birc6，Ddx51和Gna14与细胞周期调节相关；Sox2，Hes5， Nup153和Nup133与干细胞特性相关，这些靶基因均经过了ChIP-qPCR和测序结果的验证（图7F，G）。最终，作者又通过实验验证的方法确定了TOP2a最可能的下游靶分子为USP37（图7H）。

图7 利用ChIP-Seq和RNA-Seq寻找TOP2a潜在的下游靶基因

（图源：Qin S, et al., Nucleic Acids Res, 2022）

USP37是一种新发现的泛素特异性蛋白酶家族的成员，可阻碍泛素介导的靶蛋白降解。它主要通过介导蛋白分子CYCLIN-A（包括 CCNA1 和 CCNA2）的去泛素化，作为细胞周期的有效调节剂，促进 G1/S 期的转换。此外，USP37 还能通过稳定CDT1调节 DNA的复制。作者发现，在TOP2a敲低的条件下，USP37及其下游靶蛋白的表达同步下降，这一效应可以通过上调USP37得到部分逆转，这进一步证明USP37是TOP2a的直接靶基因（图8A-E）。同时，由TOP2a抑制引起的神经球数目和大小的下降，也能通过上调USP37而恢复到相当可观的水平（图8F,G）。最后，通过定点注射USP37的过表达慢病毒，作者发现条件敲除小鼠体内的成体神经发生受抑制情况也得到了一定程度逆转（图8H,I）。总之，这些数据表明USP37作为TOP2a的直接靶基因发挥着作用，在TOP2a的调控下可参与维持成体NSCs的增殖活性。

图8 过表达USP37能够逆转TOP2a敲除后对成体神经发生的抑制作用

（图源：Qin S, et al., Nucleic Acids Res, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上，鉴于之前对拓扑异构酶ⅡA（TOP2a）的研究几乎全部集中在细胞周期调节和肿瘤发生领域，研究者首次在成体神经发生领域研究该分子的表达、功能和调控机制。此研究有助于人们全面认识TOP2a的分子功能，也为成体神经干细胞的增殖、自我更新以及分化提供新的分子调控机制，为临床上运用干细胞治疗神经损伤、变性等疾病提供新的思路和理论依据。当然，有一点值得注意的是，TOP2a的ChIP-Seq实验中大多数富集峰位于基因间或内含子，这表明TOP2a的调控功能还可能跟染色质的构象、3D基因组折叠等机制相关。据报道TOP1和TOP2b可以通过RNA聚合酶II启动子近端暂停机制和DSB的富集来协调转录激活。因此，其他调节途径有可能共同促成了TOP2a在转录过程中的作用，这些问题都需要进一步的深入研究来解决。

原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkac731

海军军医大学基础医学院秦尚尧讲师为本文第一作者，袁一旻讲师为共同第一作者，何成教授和苏志达教授为本文通讯作者。

该研究受到中国科技部脑计划（2022ZD0204702），国家自然科学基金（81971161、82171386、31871026、82002012），上海市科技发展基金（22YF1458600），海军军医大学基金（2021QN08）和上海市科技部重大专项（No.2018SHZDZX01）的资助支持。

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参考文献（上下滑动阅读） 

1.     Chen SH, Chan N-L, Hsieh T-s. New Mechanistic and Functional Insights into DNA Topoisomerases. Annual Review of Biochemistry. 2013;82(1):139-70.

2.     Wang JC. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002;3(6):430-40.

3.     35. Nielsen, Christian F.; Zhang, Tao; Barisic, Marin; Kalitsis, Paul; Hudson, Damien F. Topoisomerase IIα is essential for maintenance of mitotic chromosome structure. PNAS. 2020;117(22); 12131–12142.

4.     Gage, F. H.; Ray, J.; Fisher, L. J. Isolation, Characterization, and use of Stem Cells from the CNS. Annual Review of Neuroscience.1995; 18: 159–92.

5.     Fuentealba LC, Rompani SB, Parraguez JI, Obernier K, Romero R, Cepko CL, et al. Embryonic Origin of Postnatal Neural Stem Cells. Cell. 015;161(7):1644-55.

本文完