Cell Prolif︱赖良学/张焜/邹庆剑团队合作成功构建了体内安全、高效定向诱导运动神经元的技术体系

撰文︱陈  敏

责编︱王思珍

编辑︱杨彬伟

特异性运动神经元的死亡是运动神经元疾病最典型、最直接的病理特征。由于神经再生能力极为有限，目前的治疗方法难以有效逆转神经损伤。干细胞可以分化为相应神经细胞以替代受损神经元，修复神经环路，为运动神经元疾病等神经退行性疾病的替代治疗带来了希望。大量临床前研究报道，多种类型的干细胞移植对运动神经元疾病的动物模型均有明显的治疗作用[1-3]。尤其是hiPSCs诱导的神经前体细胞被认为是治疗运动神经元疾病等神经退行性疾病最理想的候选细胞来源[4]，但是仍然存在移植细胞数量不足、分化效率不高、移植后存活能力差等局限性。

2022年8月10日，中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员团队、五邑大学生物科技与大健康学院张焜教授团队和邹庆剑副教授团队合作在Cell Proliferation上发表了题为“Inducible motor neuron differentiation of human induced pluripotent stem cells in vivo”的研究。该从体内定向分化的角度出发，通过对人诱导多能干细胞（hiPSCs）进行基因修饰：①转入Tet-on运动神经元转录因子Ngn2、Isl1、Lhx3条件性表达系统；②过表达抗凋亡因子Bcl-xL。成功构建获得具有抵抗凋亡和可高效定向诱导为运动神经元的干细胞系NILB-hiPSCs，为运动神经元疾病的干细胞治疗提供可靠的实验依据和临床前方案。

作者首先将已构建两个PB载体（①PB-NIL：条件性表达运动神经元转录因子Ngn2-Isl1-Lhx3；②PB-BLG过表达抗凋亡基因Bcl-xL和标记基因Luciferase、EGFP）转入hiPSCs，经抗生素筛选得到两株阳性细胞克隆NIL-hiPSCs（只转染PB-NIL）和NILB-hiPSCs（同时转染PB-NIL+PB-BLG）（图1A）。其中NILB-hiPSCs具有正常的干细胞增殖能力（图1B）；并且凋亡率（5.43%）显著低于NIL-hiPSCs（24.22%）（图1C）。加入强力霉素（doxycycline，Dox）处理48 h后，转基因Ngn2、Isl1、Lhx3的表达水平均显著升高（图1D）。Dox处理5天后，NILB-hiPSCs所分化的神经元广泛表达相关marker，包括神经元通用marker TUJ1、神经元早期成熟marker MAP2、运动神经元特异性marker HB9和运动神经元晚期成熟ChAT（图1E）。并且，这些成熟的运动神经元能够产生动作电位和Na⁺、Ka⁺离子电流（图1F），说明NILB-hiPSCs在体外可以定向分化为功能成熟的运动神经元。

图1  多基因修饰hiPSCs细胞系NILB-hiPSCs的建立

（图源：Min Chen et al., Cell Proliferation,2022）

有趣的是，将培养时间延长至2周以上，作者在成熟的神经元之间观察到一群非神经元细胞的产生；这群细胞大量表达神经前体细胞的marker SOX2，PAX6，以及增殖marker Ki67，同时形成了典型的神经花环样结构。若培养至第4周，大量细胞还表达运动神经元前体细胞marker OLIG2（图2A）。为了获得这些前体细胞，作者将第4周的混合细胞（运动神经元+神经前体细胞）进行传代。存活下来的神经前体细胞在不加入Dox的运动神经元诱导培养基中，也可以快速高效分化为神经元（图2B）。并且，二次分化的神经元大量表达运动神经元相关marker TUJ1、MAP2、HB9和ChAT（图2C）。此外，作者在传代应激模型上，考察Bcl-xl对运动神经元存活率的影响。结果如图所示，传代后NILB-hiPSCs诱导的运动神经元的存活率远高于NIL-hiPSCs组（图2D）。因此，作者选用NILB-hiPSCs进行后续体内实验。

图2   长期分化NILB-hiPSCs产生神经前体细胞

（图源：Min Chen et al., Cell Proliferation, 2022）

作者将NILB-hiPSCs直接注射到免疫缺陷小鼠的皮下组织考察体内分化情况。腹腔注射Dox（25 mg/kg，5 days）诱导Ngn2、Isl1、Lhx3的表达，未诱导组给予等量的PBS。活体成像结果显示，未诱导组中Luciferase的活性随时间而迅速增加，未分化的hiPSCs在皮下组织中迅猛增殖。相反的，Dox诱导组中Luciferase的活性随时间而迅速下降，最后在第8周的时候基本消失（图3A）。以上实验结果表明Dox诱导皮下注射的NILB-hiPSCs不会形成畸胎瘤，其安全性较高。此外，作者通过免疫荧光对皮下的细胞团块进行鉴定，发现移植的NILB-hiPSCs在皮下主要以神经分化方向为主，大量表达运动神经元相关marker TUJ1、MAP2、HB9和ChAT（图3B）。在第4周的样品中，作者观察到大量的腔室结构，并表达神经前体细胞marker SOX2和PAX6，以及增殖marker Ki67（图3C）。为了进一步考察NILB-hiPSCs在皮下分化的细胞类型，作者把移植第4周的细胞团块取出后，进行体外培养（图3D）。原代细胞也会形成了花环样结构，并表达神经前体细胞marker SOX2和PAX6（图3E）；同时，在不加入Dox运动神经元诱导培养基中也可以快速高效分化为运动神经元（图3F），与体外观察到的实验现象一致。

图3  皮下注射NILB-hiPSCs的体内分化情况

（图源：Min Chen et al., Cell Proliferation, 2022）

在运动神经元疾病中，患者脊髓中的运动神经元广泛死亡，因此作者把NILB-hiPSCs注射到免疫缺陷小鼠脊髓组织，考察其存活和分化。与皮下注射类似的是，移植到脊髓的细胞，前2周大量减少，但是第4周细胞数目出现了反弹，然后稳定存活到第20周（图4A和B）。免疫荧光染色结果显示，NILB-hiPSCs在小鼠脊髓中，形成神经突触等结构；并且，大量的细胞表达神经元marker TUJ1、MAP2、HB9和ChAT（图4C）。更重要的是，移植细胞整合到小鼠脊髓组织中，产生了很强的动作电位和离子电流（图4D）。说明NILB-hiPSCs在脊髓组织中可以定向分化为功能成熟的运动神经元。

与皮下移植类似的，注射到脊髓的细胞也形成了腔室样结构，并表达神经前体细胞的marker SOX2和PAX6（图4E），以及增殖marker Ki67（图4F），说明移植的细胞在脊髓中可以继续增殖。意料之外的是，小部分细胞还表达OLIG2（图4G），说明神经前体细胞进一步分化为了运动神经元前体细胞。以上结果说明了，移植细胞能够在脊髓组织中存活5个月，并分化为运动神经元、神经前体细胞、运动神经元前体细胞的混合的细胞群。

图4脊髓注射NILB-hiPSCs的体内分化情况

（图源：Min Chen et al., Cell Proliferation, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究首次将干细胞体外基因修饰与体内诱导分化技术相结合，成功构建了体内高效、定向诱导运动神经元的技术体系。后续将围绕NILB-hiPSCs对MNDs动物模型的治疗作用展开深入研究。更重要的是，hiPSCs通过转录因子可以分化为各种类型的体细胞，如果将Ngn2-Isl1-Lhx3换成其他细胞特异性的转录因子（比如肝脏特异性转录因子Foxa3-Hnf1A-Hnf4A，肾脏特异性转录因子Six2），可以在体内诱导多种类型的功能细胞，而后用于相应疾病的移植治疗。由此可见，该研究不仅为MNDs干细胞治疗提供了一种新的策略，对于其他疾病也有重要的价值和意义。但由于本研究使用的是转座子载体，可能使外源基因整合到基因组关键位置，引起干细胞癌变或分化过程不可控等安全性担忧。在近期发表的另一篇文章中，本团队通过引入药物诱导多能性干细胞自杀的方式清除体内无法分化的细胞，一定程度上提高了干细胞体内治疗的安全性[5]。未来也可以通过定点整合外源基因的方式，最大限度减小转基因给细胞治疗带来的安全性风险。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/cpr.13319

中科院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员、五邑大学生物科技与大健康学院邹庆剑副教授、张焜教授是该论文的共同通讯作者，五邑大学生物科技与大健康学院陈敏博士，硕士研究生李川以及生物岛实验室王霞为该论文的共同第一作者。

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参考文献（上下滑动阅读） 

1 Wyatt T J, Rossi S L, Siegenthaler M M, et al. Human motor neuron progenitor transplantation leads to endogenous neuronal sparing in 3 models of motor neuron loss. Stem cells international, 2011, 2011.
2 Xu L, Yan J, Chen D, et al. Human neural stem cell grafts ameliorate motor neuron disease in SOD-1 transgenic rats. Transplantation, 2006, 82(7): 865-875.
3 Popescu I R, Nicaise C, Liu S, et al. Neural progenitors derived from human induced pluripotent stem cells survive and differentiate upon transplantation into a rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Stem cells translational medicine, 2013, 2(3): 167-174

4 Itzhak F, Jennifer N D, Michael A L.Transplanting neural progenitor cells to restore connectivity after spinal cord injury, Nature Review Neuroscience, 2020, 21(7): 366-383

5 Liu Y, Yang Y, Suo Y, et al. Inducible caspase-9 suicide gene under control of endogenous oct4 to safeguard mouse and human pluripotent stem cell therapy. Mol Ther Methods Clin Dev, 2022, 24: 332-41

本文完