Neuron｜胡扬课题组揭示大量促进视神经再生的基因及其在青光眼小鼠中显著的神经保护作用
撰文︱冯 雪
责编︱王思珍
编辑︱杨彬伟
青光眼（glaucoma）的症状包括早期的视神经退化，及后期的视网膜神经节细胞（Retina Ganglion Cells，RGCs）进行性死亡[1-4]。这些是导致不可逆失明的主要原因[5,6]。青光眼的神经变性可能是由于眼内压（IOP）升高引起的视神经的机械性损伤[7]。而在现阶段通过降低IOP无法完全阻止青光眼神经神经变性的进程[8-10]，且成年人RGCs在退化/退行后无法自发再生。因此，我们亟需新的治疗方法。而防止视神经退行，促进视神经修复是治疗青光眼的根本出发点。
敲除RGCs中的PTEN（phosphatase and tensin homolog），是目前最有效的，仅通过操纵单基因即能显著促进视神经再生的方法[11-13]。然而，PTEN作为肿瘤抑制因子，其活性紊乱与多种疾病有关，包括代谢疾病及肿瘤的形成认知障碍甚至衰老[14]。因此，怎样通过调节PTEN相关的下游效应因子（effector）来最大限度提高轴突再生和拯救神经退行变性的RGC的同时最大限度的减少副作用显得极其重要。
2022年8月10日，美国斯坦福大学胡杨团队在《神经元》（Neuron）上发表了题为“Single Cell Transcriptome Analysis of Regenerating RGCs Reveals Potent Glaucoma Neural Repair Genes ”的研究论文，通过使用单细胞测序技术发现了大量可促进损伤后视神再生的基因，这些基因可保护青光眼模型中的RGCs。该论文与同期另外两篇相关论文被汇总为封面主题。
青光眼与视神经损伤模型（optical nerve crush，ONC）不同，因为其轴突损伤不完整，因此无法在所有存活的RGCs中区分出有再生能力的RGCs（regRGCs）。且有研究表明，从ONC模型中regRGCs里筛选出的视神经再生相关基因（regeneration-associated genes，RAGs）可能是青光眼神经修复的候选基因[15]。
为了研究青光眼中可防止视神经退行、促进视神经再生的基因，研究人员以Pten敲除后的ONC小鼠模型为基础，设计了反向追踪标记的方法来区分能够再生神经轴突的RGCs（regRGCs）和存活下来但不能再生轴突的RGCs（surRGCs），从而寻找视神经再生相关基因（RAGs），再进而探究这些基因在青光眼RGCs/轴突中的保护作用。
首先，在视神经损伤前，通过在视丘（superior colliculus，SC）注射RetroBeads-Green反向标记RGCs；在视神经损伤后14天，于距视神经损伤远端1 mm处注射Dextran-Texas Red反向标记90% regRGCs。在所有存活的RGCs中，仅被绿色标记（排除被红色标记）为仅存活但无再生能力的RGCs，即surRGCs。此反向标记方法极大程度上提高了样本收集的准确性，即表明了此反向标记方法的有效性和可行性（图1）。
图1 regRGCs和surRGCs的反向标记
（图源：Liang Li, et al., Neuron, 2022）
于是，接下来，研究人员选择使用Pten敲除的ONC小鼠，通过反向追踪标记surRGCs及regRGCs，再利用Smart-seq2单细胞测序技术检测两组细胞内的差异表达基因，最终筛选出regRGCs中高表达的基因。通过GO分析发现，这些基因主要富集在脂质定位、细胞粘附、迁移和代谢过程的调节相关等通路中（图2）。
图2 regRGCs 和surRGCs Smart-Seq2转录组对比分析
（图源：Liang Li, et al., Neuron, 2022）
那么，上述筛选到的regRGCs中高表达的基因是否的确能够促进损伤后的视神经再生呢？为此，研究人员选取了在regRGCs中高表达且参与到被富集通路中的基因Anxa2、Plin2、Mpp1、Acaa2、Spp1、Lgals1和Gpnmb，进行了验证（图2）。以AAV2介导，使用mSncg启动子驱动，专一过表达于RGCs中，并在ONC后检测视神经是否再生。结果发现，Anxa2、Plin2、Mpp1、Acaa2、Spp1以及Lgals1均可在不同程度上促进视神经再生。其中Anxa2 的促进作用最为显著，也是目前已测试的基因中唯一一个可增加 ONC后RGCs 存活率的基因（图3）。
图3 Anxa2 可显著促进ONC后视神经再生
（图源：Liang Li, et al., Neuron, 2022）
进一步地，作者使用临床相关的硅油诱导的高眼压青光眼小鼠模型（silicone oil-induced ocular hypertension，SOHU）[16-18] 来检测视神经再生相关基因（RAGs）是否能增强青光眼中RGC/视神经的修复。研究选取Anxa2和Mpp1及两个促进再生较弱的基因Plin2和 Lgals1。基因过表达14天后，单眼注射硅油构建青光眼模型，对侧眼注射等体积PBS作为对照组。硅油注射3周后，使用光学相干断层扫描（optical coherence tomography，OCT）检测视网膜神经节细胞复合体（retinal ganglion cell complex，GCC）厚度及眼压（intraocular pressure，IOP）。OCT结果显示Anxa2和Mpp1显著增加SOHU眼的GCC厚度（图4A）。组织学结果分析与在体OCT结果一致，Anxa2 和 Mpp1的过表达显著增加了对RGC的保护作用（图4B）。相比之下，Plin2和Lgals1均未表现出显著的RGCs 保护作用。视神经的半薄切片进一步证实Anxa2 和 Mpp1在青光眼中有显著的轴突保护作用（图4D, E）。
图4 RGCs中过表达 Anxa2 和 Mpp1 可显著提高 SOHU 青光眼模型中的RGCs胞体和轴突的存活率，并保护视觉功能
（图源：Liang Li, et al., Neuron, 2022）
除了维持RGCs形态的完整性，那么RAGs能否进一步维持或改善视觉功能呢，这对于视神经修复是否起到功能性的作用（结果）至关重要。研究人员使用视动追踪反应（OKR）及模式视网膜电图（PERG）对小鼠视力进行了评估。实验结果与组织形态学结果相一致，在SOHU模型中，过表达Anxa2 和 Mpp1对小鼠RGCs及视觉功能均有显著的保护作用（图4F, G）。
Anxa2蛋白作为一种细胞表面的膜蛋白，其功能之一是作为组织纤溶酶原激活物（tPA）的细胞表面受体发挥作用，因此参与纤溶酶相关的细胞过程，例如纤溶、细胞外基质（ECM）降解、细胞迁移和癌细胞侵袭[19-22]；同时，tPA本身也可促进ONC模型中视神经再生（图5 A, B）。这些结果提示 tPA 可能协同 Anxa2 促进轴突再生。在此，研究人员通过Anxa2过表达、Pten 敲除和tPA 给药，三重组合，显著提高了ONC后视神经的再生能力（图5 A,B）。此外，RGCs的存活率也显著提高（图5 C, D）。
图5 Anxa2 过表达/ tPA 给药/Pten 敲除协同作用促进 ONC 后视神经再生和 RGCs的存活
（图源：Liang Li, et al., Neuron, 2022）
在此项研究中，研究人员仅解释了Anxa2引起视神经损伤后再生的机制，并未研究其余RAGs促进视神经再生的机理及所有RAGs在青光眼模型中对RGCs/视神经的保护机制。所以，仍需大量的研究来指导Anxa2及Mpp1在青光眼治疗中的应用。
总体而言，此研究中样本收集的准确性使得研究人员更易检测到可促进视神经再生的基因，这些结果综合提示了这种创新性的反向标记方法在筛选视神经再生相关基因及研究基因相关生理及病理功能方面的强大的潜在价值。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.06.022
本文是由斯坦福博士后李亮，湘雅医院方芳、斯坦福博士后冯雪、斯坦福庄佩共同担任第一作者，斯坦福胡扬教授为该论文的通讯作者。本研究与斯坦福丛乐教授和齐磊教授实验室合作完成。
由左至右：李亮，方芳，冯雪，庄佩，胡扬
（照片提供自：斯坦福大学胡扬实验室）
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本文完