Nat Commun︱彭岳青团队发现新的控制非快速动眼睡眠的脑区

来源︱“逻辑神经科学”姊妹号“岚翰生命科学”

撰文︱滕洒洒，彭岳青

责编︱方以一，王思珍

编辑︱方以一，杨彬伟

睡眠是动物界普便存在的现象，人一生大概有三分之一的时间花在睡眠上，充足的优质睡眠有助于身心健康。睡眠不足会导致心血管疾病， 免疫力低下，代谢紊乱， 精神疾病等相关健康问题。根据世界卫生组织统计， 全球27% 的人存在睡眠问题，即每四个人中至少有1人， 这个数字还在不断攀升。因此研究大脑是如何控制睡眠是一个非常重要的神经生物学问题。入睡和唤醒是由不同的神经环路精确控制，促进入睡的神经环路和促进唤醒的神经环路是一种相互抑制的开关模式[1, 2]。之前的研究已经发现了很多促进唤醒的神经递质和神经环路[3-5]，但是促进睡觉的神经环路研究相对还比较少，而且那些脑区是参与睡眠起始还是睡眠维持也不明确[5, 6]。因此，深入研究并且揭示新的控制睡眠的脑区和神经环路具有重要的意义。

2022年8月12日，哥伦比亚大学医学院滕洒洒（第一作者），彭岳青（通讯作者）等人在Nature Communications上发表了题为“Control of non-REM sleep by ventrolateral medulla glutamatergic neurons projecting to the preoptic area”的研究，发现了一个新的控制睡眠的兴奋性的脑干-下丘脑神经环路。

本研究致力于发现未知的参与控制从清醒到non-REM（NREM sleep非快速动眼睡眠） 睡眠行为的神经元环路。为了探索在清醒 -睡眠转换时全脑小鼠中有哪些未知脑区可能被激活，作者设计了反复切换睡眠剥夺实验并且通过cFos蛋白表达的免疫化学染色对全脑切片进行筛选。作者发现与对照组相比在睡眠剥夺组小鼠的腹外侧延髓（ventrolateral medulla，VLM） 脑区存在有一群神经元会被激活并表达cFos蛋白。（cFos蛋白被广泛用作筛选即时激活神经元的标记物） 通过原位荧光杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH) 以及病毒追踪实验证明，这些VLM神经元是谷氨酸能兴奋性神经元，其投射到与睡眠行为密切相关的下丘脑视前区（preoptic area，POA）。

作者推测，如果这些新发现的VLM神经元参与对睡眠行为的控制，那么它们应当在睡眠，尤其是清醒—睡眠过度期被激活。因此观测并记录它们的活动将是一个重要的证据。一般的荧光显微镜只可以观察到很浅的深度，即使使用双光子显微镜也只能观察到不到1毫米的深度，然而这些对睡眠起重要作用的细胞位于颅骨以内大约5mm深的区域。因此如何记录其活动是一大难点。彭岳青团队通过GRIN lens microendoscopy 技术成功观察并记录到了这些位于VLM深脑的神经元活动并且使用EEG/EMG同步记录脑电/肌电活动以便检测小鼠的睡眠状态（图1）。该实验验证了一部分VLM脑区的谷氨酸能神经元在NREM睡眠期间存在较高的活动。有趣的是，作者对从清醒-NREM睡眠的转换期的神经活动进行进一步分析发现，这群VLM谷氨酸能神经元在进入NREM睡眠初期显示了更高的神经活动，而后期从NREM睡眠到觉醒的神经活动基本没有变化，暗示其可能在清醒-NREM睡眠转换中发挥重要功能。

图1 睡眠期脑干VLM谷氨酸能神经元实时成像

(图源：Teng, S., et al. Nat Commun, 2022)

如何证明新发现的VLM神经元可以控制大脑进入睡眠？在现代神经生物学中，科学家可以通过设计Gain-of-function（获得性功能实验）策略来进行验证。即通过人工激活某一脑区/细胞来观察实验动物被触发了哪种生理行为。在本研究中，作者通过在VLM谷氨酸能神经元中特意表达ChR2工具蛋白，通过光遗传学（optogenetics）方法选择性激活目标神经元来验证这些神经元的激活是否可以引起实验小鼠进入NREM睡眠。实验表明光遗传学刺激之后，小鼠迅速从清醒转换到NREM睡眠,成功率高达80%以上（图2）。

作者进一步发现，对该VLM投射到下丘脑POA区域的神经末梢进行光遗传学刺激同样可以引发NREM睡眠。与胞体刺激相比，末梢刺激可以触发小鼠瞬时入睡，而胞体刺激需要等刺激结束后才引发睡眠。作者发现该现象是因为在VLM脑区同时存在控制小鼠入睡的神经元与控制小鼠运动的神经元。因此在光遗传学刺激期间运动神经元的激活阻止了小鼠入睡，而在刺激结束之后小鼠仍然能成功入睡。这组实验表明，VLM脑区投射到下丘脑POA区域的谷氨酸能神经元控制着小鼠从清醒到NREM睡眠的转变，即入睡的生理过程（图2）。

图2 光遗传性激活POA投射的VLM谷氨酸能神经元引起清醒动物进入NREM睡眠

(图源：Teng, S., et al. Nat Commun, 2022)

该团队通过化学遗传学（chemogenetics）方法激活或者抑制该脑区投射到下丘脑的谷氨酸能神经元，进一步证实了这些神经细胞对进入NREM睡眠是充分且必要的。在化学遗传学抑制实验中，抑制这些VLM神经元的活动有效地减少了小鼠的睡眠时间。进一步分析表明实验小鼠进入NREM睡眠的次数显著减少而每次NREM睡眠的时长并没有改变，说明VLM谷氨酸能神经元的活动在动物控制从清醒进入NREM睡眠的生理过程中必不可缺。

文章结论与讨论，（未来）启发与展望

综上所述，该团队发现了在脑干腹外侧延髓（VLM）脑区的谷氨酸能神经元在NREM睡眠期兴奋，并且该神经元的激活控制着小鼠从清醒状态进入NREM睡眠状态的过程。作者进一步证明了从脑干VLM脑区到下丘脑POA脑区的神经投射介导了该生理功能。大多数的生理刺激都可以改变动物的警觉状态，因此发现介导清醒的脑区相对容易，而发现真正控制进入睡眠的脑区难度更大。在以往关于清醒与睡眠的研究中，大量的研究发现刺激很多脑区都可以引起动物从睡眠进入清醒，而只有少数研究报道了诱导睡眠的脑区。对于控制动物从清醒进入NREM睡眠的生理机制此前并不太清楚。该研究的发现填补了这个空白，打开了研究入睡机制的一道大门。另外，以往发现控制睡眠的细胞绝大多数是抑制性神经元，该研究揭示了兴奋性神经元在控制睡眠中的作用。这些发现有助于阐明动物NREM睡眠控制的机制问题，并且对治疗睡眠障碍的研究带来更深入的见解。本研究也存在不足之处，一方面，如文中指出，除了POA以外，VLM谷氨酸能神经元还投射到其他脑区，由于时间有限，本研究未能对其他下游脑区作功能性验证；另一方面，本研究未能对VLM谷氨酸能神经元的输入（input）部分作进一步的阐明，从而对何种神经信号在入睡期间激活VLM神经元缺乏认识。今后的研究可以从揭示输入神经元或者输入分子信号入手，进一步完善VLM上下游环路在控制NREM睡眠的作用。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-32461-3

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[1] Saper, C. B., Chou, T. C. & Scammell, T. E. The sleep switch: hypothalamic control of sleep and wakefulness. Trends Neurosci 24, 726-731 (2001).

[2] Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J. & Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron 68, 1023-1042, doi:10.1016/j.neuron.2010.11.032 (2010).

[3] Brown, R. E., Basheer, R., McKenna, J. T., Strecker, R. E. & McCarley, R. W. Control of sleep and wakefulness. Physiol Rev 92, 1087-1187, doi:10.1152/physrev.00032.2011 (2012).

[4] Lee, S. H. & Dan, Y. Neuromodulation of brain states. Neuron 76, 209-222, doi:10.1016/j.neuron.2012.09.012 (2012).

[5] Scammell, T. E., Arrigoni, E. & Lipton, J. O. Neural Circuitry of Wakefulness and Sleep. Neuron 93, 747-765, doi:10.1016/j.neuron.2017.01.014 (2017).

[6] Weber, F. & Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature 538, 51-59, doi:10.1038/nature19773 (2016).

本文完