Front Mol Neurosci︱陈军课题组揭示脊髓背角的继发性神经损伤与神经炎症介导丘脑出血性卒中后疼痛
撰文︱孙薇，梁婷
责编︱王思珍
编辑︱杨彬伟
中风（stroke）是全球死亡和残疾的重要原因之一。2019年的数据统计显示，中风导致了全球约1.43亿失能生活年（disability adjusted life year）和655万人死亡[1, 2]。中枢脑卒中后疼痛（central post stroke pain，CPSP）是中风最棘手的后遗症之一。根据国际疾病分类-11（ICD-11）修订版分类，CPSP可定义为一种典型的、慢性中枢神经病理性疼痛，可由躯体感觉系统任一节段的缺血性或出血性损伤或病变引起[3-5]。CPSP的发病率与患者年龄、性别、以及卒中的侧别无明确联系，但与病灶的位置有关，其中位于脊髓及丘脑的卒中患者CPSP发生率最高[6]。尽管临床上，三环类抗抑郁药物（阿米替林和丙咪嗪）、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（氟西汀）以及抗惊厥药物（加巴喷丁和普瑞加林）可部分缓解CPSP[7]，但是长期服药效果不确定，此外运动皮层电刺激和脊髓电刺激等神经调节方法效果也只在40-50%的病人有效，约有50%-60%患者属于顽固性疼痛，因疼痛难忍而轻生自杀者逐渐增多。迄今为止，人们对CPSP潜在机制的了解仍不足，这可能是目前寻找有效治疗方法的重大阻碍。
鉴于以上背景，课题组近些年来利用大鼠丘脑出血性卒中后疼痛模型，发现：（1）丘脑出血的部位与疼痛发生有密切联系，如出血灶累及脊丘系、丘脑腹侧基底核群和丘脑后核群等可引起痛敏，其它部位少有[8]；（2）长期给予加巴喷丁或普瑞巴林等抗惊厥类药物治疗丘脑出血性卒中后疼痛有耐药现象，耐药原因可能与脱靶效应有关，如实验显示加巴喷丁类药物靶分子α2δ1在丘脑出血后第1-2周表达增高，但在第3-4周开始表达下调恢复至正常水平，所以药物在丘脑出血后第1-2周效果最好，但从第3周开始药效减弱，不得已增量，药物剂量大头晕嗜睡等副作用显著[8,9]；（3）丘脑出血灶周边的神经损伤和神经炎症对维持CPSP有重要作用，实验证明免疫趋化因子SDF1-CXCR4信号通路参与介导胶质细胞-胶质细胞、胶质细胞--神经元互作引起神经炎症反应，如果用药物如CXCR4拮抗剂或小胶质细胞或星形胶质细胞代谢抑制剂对抗丘脑出血损伤引起的神经炎症可以缓解CPSP，但如何给药是个不太容易实现的问题[10]。
基于以往的数据分析，本文作者们发现丘脑出血损伤不仅可以使丘脑的α2δ1分子蛋白表达上调，双侧脊髓背角的α2δ1表达也上调，暗示脊髓水平有继发性损伤[9]；此外，CPSP相关联的痛敏（即皮肤刺激引起缩足反射易化）是脊髓节段增敏机制，那么脊髓节段在丘脑出血损伤引起的双侧机械性痛敏有什么作用呢？这些都是尚不清楚的未解之谜。
为了探索这些问题的答案，课题组基于神经轴突逆行溃变（retrograde axonal degeneration）理论知识，假设丘脑出血后除了导致局部出血灶和周边神经元死亡之外，也一定导致起源于脊髓背角的脊髓丘脑束（spinothalamic tract，STT）神经元投射纤维轴突终末的损伤，那么损伤的轴突终末会沿着神经纤维发生逆行溃变，最终会使脊髓背角中的神经元胞体和突起发生继发性变性坏死，而变性坏死的神经组织会引起继发性神经炎症，脊髓背角继发性神经炎症会使存活的参与脊髓背角-脊髓前角屈肌反射环路的神经元敏化，继而引起痛敏。如果这一假设成立的话，那么在脊髓节段通过鞘内给药镇痛抗炎也可以缓解CPSP，这将为解决CPSP治疗路径提供新方案。
2022年8月12日，空军军医大学第二附属医院陈军教授课题组在Frontiers in Molecular Neuroscience上发表了题为“Secondary damage and neuroinflammation in the spinal dorsal horn mediate post-thalamic haemorrhagic stroke pain hypersensitivity: SDF1-CXCR4 signaling mediation”的研究论文，提出脊髓背角的继发性神经损伤和炎症参与调控丘脑出血性CPSP的发生。在此研究中发现丘脑出血性卒中原发部位的神经元损伤和炎症通过STT的逆行性溃变，导致脊髓背角STT投射神经元胞体发生死亡、从而诱发继发性神经炎症及神经元超兴奋，进而易化脊髓屈肌反射，出现机械性痛敏。该研究丰富了我们对丘脑出血性CPSP发生机制的认识，也为在脊髓水平治疗CPSP提供一条新途径和新策略，具有重要的科学和临床意义。
既往研究已经证实丘脑内注射IV型胶原酶（ITC）所产生的区域特异性出血性卒中可导致大鼠双侧机械性痛觉过敏，丘脑的原发损伤部位会出现严重的神经炎症反应及神经元死亡性损伤[8-12]。这种位于丘脑的损伤会诱发脊髓屈肌反射的易化（机械刺激缩足反射），然而其中的神经作用机制仍不清楚。为了进一步揭示丘脑出血性CPSP的脊髓机制，该研究聚焦由STT逆行性溃变诱发的脊髓背角继发性神经炎症和STT投射神经元的死亡（图1）。
图1 实验流程图和假说图
（图源：Liang T. et al.,Front Mol Neurosci, 2022）
图2 CPSP组大鼠脊髓背角的促凋亡因子和TUNEL标记神经元均增多。
（图源：Liang T. et al., Front Mol Neurosci, 2022）
利用免疫荧光标记及Western Blot方法，作者观察到：ITC注射后7天，大鼠脊髓背角的凋亡抑制因子Bcl-2标记的神经元减少，而促凋亡因子Bax和TUNEL标记的神经元显着增加，而丘脑内生理盐水注射（ITS）没有这种效果，蛋白定量分析也验证了这些变化（图2）。电镜观察发现：ITC注射后7天，脊髓背角有明显的神经元变性和突触结构缺失，而ITS组无明显改变（图3）。脊髓背角的多电极阵列（多电极阵列包含2 tetrode x 4 = 32 channels）记录发现：记录到的三种不同类型神经元—低阈值机械感受性 (LTM)、广动力阈(WDR)、伤害特异感受性（NS）神经元均发生丢失（图4）。上述结果提示丘脑出血性卒中导致的原发性丘脑神经元死亡和神经炎症可通过STT逆行性溃变导致脊髓背角神经元继发性死亡。
图3 CPSP组大鼠的脊髓背角有明显的神经元变性和突触结构缺失。
（图源：Liang T. et al.,Front Mol Neurosci, 2022）
图4 CPSP组大鼠的脊髓背角LTM、WDR、NS神经元均发生丢失。
（图源：Liang T. et al., Front Mol Neurosci, 2022）
而后，课题组又检测了丘脑出血性卒中引起的逆行溃变是否会诱导脊髓背角继发性神经炎症。结果表明：在ITC 注射7天后，Iba-1（小胶质细胞生物标志物）、GFAP（星形胶质细胞生物标志物）和趋化因子SDF-1及其受体 CXCR4标记的细胞在脊髓背侧显著增加（图5A-B）, ITS组则无这种反应。脊髓背角中CXCR4与NeuN-、Iba1-和 GFAP-表达共定位约40%-50%（图5C-D）。蛋白印迹分析还显示双侧脊髓背角Iba1和GFAP以及SDF1和CXCR4的蛋白表达水平均显着增加（图5E-F）。以上这些结果证实在原发性丘脑出血性卒中后，可通过STT逆行溃变引起脊髓背角发生继发性神经炎症。
图5 CPSP组大鼠的脊髓背角发生明显的继发性神经炎症。
（图源：Liang T. et al., Front Mol Neurosci, 2022）
为了验证活体CPSP大鼠脊髓背角神经元中是否存在中枢敏化。MEA记录分析发现：ITS和ITC组3种脊髓背角单元（LTM、WDR、NS）可分为两个类型，即自发放电型（ITC vs. ITS: 46 vs. 275个单位）和非自发放电型（ITC vs. ITS: 121 vs. 279个单位）（图6A-B）。在ITS或ITC组的非自发放电型神经元中，LTM、WDR和NS神经元对刷、压和捏刺激的脉冲响应的频率分布概率在图6C中显示。LTM、WDR和NS神经元的峰反应频率均与刺激强度有关，在高强度机械刺激（压力和挤压）刺激下，ITC组对WDR、NS和LTM的峰反应频率均高于ITS组。这些结果表明，在继发性神经损伤诱导的神经炎症反应下，存活的非自发型脊髓背角神经元中存在着中枢敏化作用。
图6 CPSP组大鼠脊髓背角的残存神经元发生超兴奋。
（图源：Liang T. et al., Front Mol Neurosci, 2022）
最后，课题组通过免疫蛋白印迹法和行为学检测，观察鞘内注射小胶质细胞抑制剂（minocycline，MC）、星形胶质细胞抑制剂（luorocitrate，FC）和CXCR4拮抗剂（AMD3100）对脊髓背角Iba1、GFAP、SDF-1和CXCR4蛋白表达水平的药理作用。结果表明，在ITC或ITS注射后第10天，鞘内注射MC、FC和AMD均能翻转脊髓背侧Iba1、GFAP、SDF1和CXCR4的高表达（图7），并缓解ITC引起的机械性痛觉过敏（图 8）。同样的鞘内注射治疗并没有改变ITS组的机械刺激基础阈值（图8）。
图7 检测鞘内注射MC、FC和AMD3100对脊髓背角的Iba1、GFAP、SDF-1和CXCR4蛋白表达水平的药理作用。
（图源：Liang T. et al., Front Mol Neurosci, 2022）
图8 鞘内注射MC、FC和AMD3100对大鼠痛行为学的影响。
（图源：Liang T. et al., Front Mol Neurosci, 2022）
原文链接：https://doi.org/10.3389/fnmol.2022.911476
该研究感谢国家自然科学基金项目(31771159)的资助以及泸州市人民政府和西南医科大学科技战略合作项目(No. 2019LZXNYDJ38)的部分资助。
通讯作者: 陈军教授
（照片提供自：陈军教授实验室）
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参考文献（上下滑动阅读）
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本文完