Nat Commun︱叶克强团队发现TrkB激动剂前药-R13可抑制骨流失

撰文︱王蒙蒙，叶克强

责编︱方以一，王思珍

编辑︱方以一

骨质疏松症（osteoporosis）是一种全身性骨病，其特点是骨量和正常骨结构的破坏导致骨脆性和骨折风险增加[1]。骨稳态取决于破骨细胞对骨骼的再吸收和成骨细胞对骨骼的形成。

脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）属于在中枢神经系统中起重要作用的神经营养因子，也可由非神经元细胞合成和释放，例如成纤维细胞、成骨细胞等[2-4]。BDNF及其TrkB受体都存在于骨骼的不同阶段形成过程，在人类成骨细胞中上调，并与骨折愈合有关[5]。BDNF可提高成骨细胞分化标志物-骨钙素的mRNA表达，可刺激细胞分化并促进新骨形成和成熟[6]。

叶克强课题组前期开发了一种前药R13，可释放7，8-DHF（BDNF模拟物）激活TrkB受体[7-9]；且发现BDNF/TrkB信号通过T322残基的Akt磷酸化抑制天冬酰胺内肽酶（AEP）的活化[10]。AEP是一种广泛表达的内切溶酶体半胱氨酸蛋白酶，在体内通过原酶原（56 kDa）分泌，并加工成具有酶活性的36 kDa成熟形式和11 kDa C-末端抑制片段。C末端截短物通过与未表征的受体结合来抑制破骨细胞分化，而活性的AEP通过骨基质蛋白纤连蛋白的降解抑制成骨细胞分化和体内骨形成。但BDNF模拟药物R13能否阻断AEP并促进骨形成仍不清楚。

2022年8月，美国埃默里大学药学院叶克强课题组在Nature Communications上发表了题为“A TrkB agonist prodrug prevents bone loss via inhibiting asparagine endopeptidase and increasing osteoprotegerin”的研究。该研究揭示了一种TrkB受体激动剂前药—R13，可通过抑制AEP和提高骨保护素(OPG)促进骨形成的功能和机制。熊婧为论文共同第一作者，叶克强教授为论文通讯作者。在此项研究中，作者发现AEP KO通过增加成骨细胞形成和抑制破骨细胞形成来减少卵巢摘除术（ovariectomy，OVX）诱导的骨丢失。从R13释放的活性药物成分7,8-DHF通过激活CREB提高OPG表达并阻断RANK-L诱导的破骨细胞生成。R13不仅通过钝化其上游转录因子C/EBPβ来抑制AEP的表达，而且通过BDNF/TrkB通路激活的Akt阻断AEP的激活，它对骨质疏松症显示出与抗RANKL抗体相似的治疗功效。（拓展阅读：叶克强课题组最新进展，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：Mol Psychiatry︱叶克强课题组揭示C/EBPβ/AEP信号通路介导了动脉粥样硬化及其诱发的阿尔兹海默症；Mol Psychiatry︱叶克强课题组揭示炎症激活的C/EBPβ/AEP信号通路介导高脂饮食诱发的糖尿病及阿尔兹海默症）

为了探索AEP在骨重塑中的作用，研究者对12周龄的AEP-/-小鼠 (AEP KO) 和WT同窝仔鼠进行OVX。结果表明OVX后，AEP KO小鼠小梁骨体积分数 (BV/TV)、Conn.D升高，结构模型指数(SMI)降低（图1a，b）。值得注意的是，OVX后血清骨钙素（骨形成的标志物）水平升高，AEP KO小鼠显着高于WT（图1c）。另外，OVX组的 RANKL/OPG比率显着高于假手术组，AEP KO小鼠低于WT小鼠，这与OVX后AEP KO组与WT组的骨密度较高相一致（图1d）。因此，AEP缺失降低了RANKL/OPG的比率，增加OVX后骨小梁密度。

图1 AEP敲除改善卵巢切除雌性小鼠的骨小梁密度

（图源：Xiong J, et al., Nat Commun, 2022）

为了进一步表征AEP在OVX诱导的骨质疏松症中的作用，研究者对OVX手术后两只动物的骨形态和白色脂肪细胞进行了H&E染色。与WT小鼠相比，OVX后AEP KO小鼠的骨中白色脂肪细胞明显减少，骨小梁增加（图2a），破骨细胞减少（图2b）。且AEP敲除缓解了OVX导致的矿物质沉积率（MAR）和骨形成率（BFR）的降低（图2d）。总之，这些数据表明AEP缺陷小鼠在OVX后表现出更高的骨形成和更低的骨吸收。

图2 AEP敲除抑制卵巢切除雌性小鼠的骨转换

（图源：Xiong J, et al., Nat Commun, 2022）

为了探索BDNF/TrkB信号在OVX诱导的骨质流失中的生物学作用，研究者使用12周龄的雌性BDNF+/- 小鼠和 WT同窝仔。OVX手术4天后，WT和BDNF+/-小鼠口服R13 (21.8 mg/kg)或空白载体，持续8周。口服R13后的OVX小鼠表现出更高的BV/TV、Conn.D，更低的SMI，和更高的Tb.Th和Tb.N（图3a，b）；OVX后R13增加了皮质骨皮质面积 (Ct.Ar) 和平均皮质厚度 (Ct.Th)，但各组之间的相对皮质骨面积与组织面积（Ct.Ar/Tt.Ar）的比率不变（图3c）。因此，口服R13显著增加骨密度（图 3d）。

为探索口服R13是否释放足够的7,8-DHF触发成骨细胞分化，研究者进行体内药代动力学研究，发现7,8-DHF分布在骨髓中呈时间依赖性增加，远高于激活原代神经元中TrkB的EC50。骨髓中 p-TrkB 信号的免疫印迹显示 7,8-DHF 浓度与神经营养信号激活相关（补充图 2b）。因此，口服R13衍生的7,8-DHF激活BDNF/TrkB信号通路。

图3 R13治疗增加血清OPG水平并缓解了WT和BDNF+/-雌性小鼠卵巢切除术诱导的骨小梁丢失

（图源：Xiong J, et al., Nat Commun, 2022）

为了进一步探索BDNF信号在OVX后骨吸收和形成中的作用，研究者对OVX手术后WT和BDNF小鼠的骨形态和白色脂肪细胞进行了H&E染色分析。R13治疗增加了骨小梁组织并降低了OVX后骨中的脂肪细胞含量（图4a）。 降低了破骨细胞（图4b），增加了MAR 和 BFR（图4c）。表明R13治疗通过增加骨形成进而缓解OVX诱导的骨丢失。OVX 后，R13治疗抑制 WT 和 BDNF+/- 小鼠的N.Oc/BS，表明R13治疗诱导骨形成并抑制OVX后的骨吸收。值得注意的是，R13在不影响RANK-L的情况下显著增加了OPG水平（补充图4）。因此，R13治疗极大地阻止了OVX引起的骨质流失并显着提高了OPG水平。

图4 R13治疗阻断了雌性小鼠卵巢切除术引起的骨转化

（图源：Xiong J, et al., Nat Commun, 2022）

7,8-DHF与TrkB受体胞外区结合，其中BDNF与TrkB受体相互作用，以依赖于TrkB的方式模拟BDNF的生物学作用。为了研究 7,8-DHF如何刺激啮齿动物骨密度升高的分子机制，研究者在OIM（成骨诱导培养基）存在下测试了其在MC3T3-E1细胞中的作用。结果表明，OIM显著提高了osterix水平，BDNF或7,8-DHF也有类似作用；且BDNF或7,8-DHF均一致了AEP活性（图5）。结果强烈支持 7,8-DHF 模拟BDNF，并且两者都强烈升高 OPG 表达并降低RANKL/OPG比率，加速成骨细胞形成。此外，它还抑制C/EBPβ/AEP通路，从而抑制破骨细胞的形成。

图5 7,8-DHF 促进MC3T3-E1细胞分化、矿化和 OPG 分泌

（图源：Xiong J, et al., Nat Commun, 2022）

为了进一步探究7,8-DHF促进OPG表达的机制，研究者在MC3T3-E1细胞中进行研究。结果表明7,8-DHF 7,8-DHF 通过激活TrkB 神经营养因子来模拟 BDNF的作用。为了检查哪些对OPG表达至关重要，在OIM和7,8-DHF存在下通过特异性siRNA在MC3T3-E1细胞中敲除相应基因，结果表明7,8-DHF 通过激活 CREB（BDNF/TrkB 通路下游转录因子）刺激OPG表达水平（图6）。

图6 7,8-DHF通过激活CREB正向调节OPG表达

（图源：Xiong J, et al., Nat Commun, 2022）

为了研究7,8-DHF促进骨形成是否也涉及抑制破骨细胞生成，研究者使用RANK-L处理RAW264.7细胞，结果表明RANK-L促进破骨细胞生成，而7,8-DHF阻断了与AEP抑制相关的RANK-L诱导的RAW264.7破骨细胞生成。鉴于R13通过增加OPG来保护骨骼，采用RANK-L抗体作为比较药物，结果表明，R13在骨密度和各种骨指数方面显示出与抗RANK-L治疗相似的功效（图 7a-c）且两种治疗方式均显著降低了RANK-L/OPG 比率（图7d）。这些发现表明R13具备与RANK-L抗体相似的治疗骨质疏松症的效果。鉴于R13已获FDA 批准用于AD 适应症的临床试验，研究者预计R13可能很快成为一种新的治疗药物，通过增强成骨细胞分化刺激骨形成和通过阻断破骨细胞生成防止骨吸收来治疗骨质疏松症；且R13通过OPG上调和AEP拮抗双重机制发挥骨保护作用，可以想象，它对患者的治疗效果可能比RANK-L抗体更强。

H&E 染色显示R13治疗和抗 RANK-L 增加了骨小梁OVX 后骨髓密度和骨中白色脂肪细胞含量降低（图8a）。 TRAP 染色表明 OVX 诱导的破骨细胞在两种处理中均明显减少（图8b）。这些结果表明，R13 在通过抑制破骨细胞减少OVX诱导的骨丢失方面表现出与抗 RANK-L 相当的效果（图8c，d）。

图7 R13和Rank-L抗体治疗在阻断WT雌性小鼠卵巢切除术诱导的小梁骨丢失方面表现出相似的效果

（图源：Xiong J, et al., Nat Commun, 2022）

图8 R13通过升高OPG和通过激活BDNF/TrkB信号抑制AEP治疗骨质疏松

（图源：Xiong J, et al., Nat Commun, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究发现BDNF模拟物-R13可以通过抑制C/EBPβ/AEP促进骨形成，并通过阻碍RANK-L诱导的RAW264.7破骨细胞生成，从而缓解骨质疏松。实验结果表明在WT和BDNF+/-小鼠上采用R13处理，均提高了其OPG，阻断了骨小梁的丢失，并显示出和抗RANK-L相似的治疗效果。 此外，AEP的敲除降低了OVX小鼠RANK-L/OPG的比值，证明AEP的抑制减弱了骨转换。从R13释放的7,8-DHF激活TrkB及其下游效应器CREB，这对于OPG增强至关重要。因此，该研究证明了R13通过抑制AEP和升高OPG发挥其对骨质疏松症的治疗功效。前人研究表明FSH会引发骨质流失，而抗FSH会在不改变雌激素浓度的情况下增加骨密度，所以FSH可能会以某种方式激活AEP和触发骨质流失。由此推想，7,8-DHF抑制FSH的产生，导致AEP的抑制和骨密度的增加，与本研究中AEP KO小鼠OVX后骨质流失减少和RANK-L/OPG 比率降低的结果相符（图8e）。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-32435-5

通讯作者：叶克强

（照片提供自：叶克强实验室）

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本文完