Mol Psychiatry︱熊伟课题组解析恐惧增强惊跳反射的神经环路机制

撰文︱郭薇薇，熊伟

责编︱王思珍

编辑︱杨彬薇

惊跳反射（startle reflex）是哺乳动物具备的一种高度保守的本能防御行为，它涉及到动物全身数百处肌肉的反应，主要表现为闭眼、面部和头颈部收缩及全身弹跳，之后往往还伴随着当下行为的中止以及心率的增加。这样的快速防御范式可以为后续进一步的防御反应做好前期准备[1, 2]。

尽管是一种本能行为，惊跳反射具有可塑性，情绪对其幅度影响尤为明显。其中，恐惧情绪可以增强动物的惊跳反射水平。具体来说，中性光刺激本身对惊跳反射并无影响。然而，当其与足底电击刺激偶联后，光刺激变成条件刺激（Conditioned stimulus，CS），而在CS存在时进行惊跳测试，记录到的反射幅度会显著增加，这一现象被称为恐惧增强惊跳反射（Fear-potentiated startle，FPS）。FPS现象不仅存在于实验动物上，大量的临床观察结果表明，创伤后应激障碍症（Post-traumatic stress disorder，PTSD）、恐慌症（Panic disorder，PD）、过度惊厥病（Hyperekplexia，HPX）及其他恐惧情绪相关的神经精神障碍类疾病患者均表现出异于常人的惊跳反射[3-5]。患者始终处于高度恐惧或者极易恐惧的状态，对周围环境过分警觉，往往一个不经意的微小刺激即可引发他们产生极强烈的惊跳反射，并进而诱发相关并发症，极大地影响了患者的生活质量。然而，目前对这一现象的生理机制尚不清楚，且现阶段临床上用于治疗PTSD、PD与HPX的药物对缓解惊跳反射异常症状的作用并不显著。因此，研究恐惧情绪通过何种环路机制增强惊跳反射将不仅有助于进一步加深目前领域内对先天防御行为的理解，也对寻找预防和治疗与恐惧和惊跳相关的神经疾病的方法有着重要的意义。

2022年9月18日，中国科学技术大学生命科学与医学部熊伟教授课题组在Molecular Psychiatry杂志上发表了题为“A midbrain-reticulotegmental circuit underlies exaggerated startle under fear emotions”的研究论文，这项工作解析了恐惧增强惊跳反射的精细神经环路及分子机制。（拓展阅读：熊伟团队最新研究成果，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：Nat Metab︱熊伟课题组阐明酒精和大麻协同导致运动毒性的新靶点）

这篇最新的Molecular Psychiatry论文中，研究人员首先在小鼠上建立FPS行为学模型（图1a-c）。通过对FPS小鼠全脑c-fos染色及目标核团网状背盖核（Reticulotegmental nucleus，RtTg）的在体钙成像记录，发现RtTg内谷氨酸能神经元活性在FPS时进一步增强（图1d-k）。特异性抑制这些神经元后，恐惧情绪造成的惊跳反射增强现象也得以抑制（图1l-n）。这提示，RtTg谷氨酸能神经元的活性上升可能是恐惧情绪下惊跳反射幅度增强的直接原因。

图1 恐惧增强惊跳反射时，小鼠RtTg内谷氨酸能神经元被进一步激活

（图源：Guo, WW et al., Mol Psychiatry, 2022）

随后，研究人员在RtTg内注射逆行追踪的Retro-AAV-EGFP病毒，发现中缝背核DRN到RtTg存在直接投射。为了验证DRN-RtTg投射，研究人员随后在Rosa-tdt报告鼠的DRN内注射跨级AAV-Cre（图2a, b）。很有意思的是，tdt标记的神经元特异性分布在RtTg外圈（RtTgP）。经染色发现，这些RtTgP的神经元为GABA能，与RtTg内部的谷氨酸神经元（RtTgC-Glu）形成包围结构。使用缺陷型RV病毒分别对RtTgP-GABA与RtTgC-Glu神经元进行逆行追踪，发现只有RtTgP-GABA神经元接受来自DRN的直接投射，且该投射为5-羟色氨能（5-HT）（图2d-f）。

图2  RtTgP-GABA神经元接受DRN-5-HT神经元的投射

（图源：Guo, WW et al., Mol Psychiatry, 2022）

脑片电生理结果表明，RtTgP-GABA对RtTgC-Glu神经元存在局部的抑制性调控。当用化学遗传手段抑制正常生理状态下RtTgP-GABA的功能后，小鼠的惊跳反射水平相应上升（图2g-j）。结合DRN-RtTgP的选择性投射，研究人员推测，恐惧状态下，DRN可能通过RtTgP作为中间桥梁影响RtTgC神经元的活性。光纤记录表明，投射到RtTgP的DRN-5-HT神经元，其钙信号上升响应于条件性恐惧刺激（图3a-d）。而随后的光遗传脑片电生理记录发现，当特异性激活DRN-RtTgP投射时，RtTgP-GABA神经元自发放电减弱，RtTgC-Glu神经元上记录到的自发抑制性突触后电流频率降低，幅度无明显变化（图3e-j）。这些结果证实了上面的猜测，即恐惧情绪激活DRN-5-HT神经元激活后对RtTgP-RtTgC抑制性微环路进行去抑制调控，使RtTgC-Glu神经元活性增强。行为学验证结果发现，化学遗传激活DRN-RtTgP投射可模拟出恐惧情绪增强惊跳反射的效应，而化学遗传抑制DRN-RtTgP投射后，小鼠的FPS水平得到了明显的恢复（图3k-n）。

图3  DRN-RtTgP-RtTgC环路介导恐惧增强惊跳反射

（图源：Guo, WW et al., Mol Psychiatry, 2022）

既然DRN通过5-HT能投射调控RtTgP-GABA中间神经元的兴奋性，那RtTgP-GABA神经元上必然会表达相应的受体介导这一调控过程。为了锁定具体的受体亚型，研究人员在RtTgP内埋管并分别注射各种5-HT不同亚型受体的特异性激动剂与拮抗剂。结果表明，当用5-HT_1B受体特异性激动剂CP93129激活RtTgP-GABA神经元上的5-HT_1B受体功能后，小鼠出现惊跳发射增强表现（图4a-c）。免疫荧光染色显示，RtTgP内GAD标记的GABA神经元共标5-HT_1B受体（图4d）。而当用5-HT_1B受体特异性拮抗剂GR55562将其抑制后，脑片光遗传激活DRN-RtTgP投射导致的RtTgP-GABA神经元自发放减少得以恢复，行为学上FPS建模小鼠的惊跳反射增强幅度也显著下降（图4e-h）。最后，研究人员构建AAV为载体的针对5-HT_1B受体的shRNA病毒，当shRNA注射到RtTgP内并敲降RtTgP-GABA上该受体的蛋白表达水平后，恐惧情绪造成的惊跳反射增强得到明显恢复（图4i-l）。以上结果表明，DRN-RtTgP-RtTgC环路介导恐惧增强惊跳反射的发生，而5-HT_1B受体是这一环路上的关键作用节点。

图4  RtTgP-GABA神经元上的5-HT_1B受体介导恐惧增强惊跳反射

（图源：Guo, WW et al., Mol Psychiatry, 2022）

图5  工作总结图：惊跳反射及恐惧增强惊跳反射的神经环路机制

（图源：中国科学技术大学熊伟实验室）

文章结论与讨论，启发与展望

总的来说，该研究从环路鉴定、神经元类型分析、递质种类判断及下游受体亚型等维度，解析了恐惧增强惊跳反射的神经环路及分子机制（图5）：首先，惊跳反射的强弱与RtTgC-Glu神经元的兴奋程度正相关。其次，RtTgP-GABA与RtTgC-Glu神经元之间存在局部抑制性微环路，该微环路的存在使得机体可以避免在正常生理状态下对外界刺激过于敏锐。最后，条件性恐惧激活DRN-5-HT神经元，通过投射到RtTgP-GABA神经元并作用到5-HT_1B受体上，进一步解除RtTgP-GABA对RtTgC-Glu的局部抑制作用，实现恐惧情绪对基础惊跳反射的增强调控。研究结果加深了现阶段领域内对高级情绪调控本能防御行为神经机制的认识，也为临床上开发能够更有效治疗惊跳反射异常的药物作用靶点及治疗方法提供了新的方向。

除条件性恐惧外，先天性恐惧（innate fear），如来自捕食者或同物种内社会等级高的强有力竞争者的威胁，同样影响机体的惊跳反射。这其中的具体行为表现，以及涉及到的关键蛋白分子、神经元亚类、核团脑区及环路连接还有待进一步的深入研究。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41380-022-01782-6

第一作者郭薇薇（第一排右第4位），第一作者范思佳（第一排右第3位），通讯作者熊伟（第一排右第7位）

（照片提供自：中国科学技术大学熊伟实验室）

作者简介（上下滑动阅读） 

熊伟（通讯作者），中国科学技术大学生命科学学院副院长、教授、博士生导师。国家杰出青年科学基金获得者，“万人计划”科技创新领军人才，科技部“十三五”重点研发计划首席科学家。熊伟教授课题组长期从事神经生物学及神经化学领域的相关科学研究，研究方向包括：脑衰老与神经退行性疾病、神经环路与神经代谢调控、新型代谢组学技术研发、离子通道调控等，并取得系列重要研究成果。研究成果发表在Cell, Nature Methods，Nature Metabolism，Nature Neuroscience，Nature Chemical Biology，Nature Communications，Journal of Experimental Medicine，PNAS，Cell Reports等国际学术期刊上。工作入选2018年度“中国生命科学十大进展”。获得过科技部重点研发计划、基金委重点项目等多项国家级基金资助。

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] LeDoux J., and Daw ND. (2018). Surviving threats: neural circuit and computational implications of a new taxonomy of defensive behaviour.Nat Rev Neurosci.19, 269-282.

[2] Guo, W., Fan, S., Xiao, D., Dong, H., Xu, G., Wan, Z., Ma, Y., Wang, Z., Xue, T., Zhou, Y., Li, Y., and Xiong, W. (2021). A Brainstem reticulotegmental neural ensemble drives acoustic startle reflexes. Nat Commun 12(1), 6403.

[3] Boecker, L., and Pauli, P. (2019) Affective startle modulation and psychopathology: Implications for appetitive and defensive brain systems. Neurosci. Biobehav Rev. 103, 230–266.

[4] Morgan, C. A. 3rd, Grillon, C., Southwick, S. M., Davis, M., and Charney, D. S. (1995). Fear-potentiated startle in posttraumatic stress disorder. Biol. Psychiatry 38, 378–385.
[5] Grillon, C., Ameli, R., Goddard, A., Woods, S. W., and Davis, M. (1994). Baseline and fear- potentiated startle in panic disorder patients. Biol. Psychiatry 35, 431–439.

本文完