CNSNT︱顾小萍团队揭示增强星形胶质细胞网络可改善长时程异氟烷麻醉引发的脑网络异常和认知功能障碍

撰文︱韩玉强，董  瑞责编︱王思珍编辑︱夏  叶
围手术期神经认知障碍（perioperative neurocognitive disorder，PND）是以手术和麻醉后短期和长期的记忆、学习和执行功能受损为特征的主要并发症，每年造成数百万患者的残疾和痛苦[1]。目前，PND发病的具体分子机制尚不清楚。从理论上讲，麻醉药应该会导致暂时的、可逆的意识和反应性丧失，而不会有任何额外的副作用。然而，大量的研究发现长期接触异氟醚可能导致认知功能障碍[2]。

既往对PND的研究主要集中在微尺度（microscale）或合胞体尺度（syncytium scale）上[3]，然而在中尺度（mesoscale）上的研究很少。所谓的中尺度的研究，指大脑不同脑区之间的功能联系变化与PND之间的关联。随着神经成像技术的发展，为在中尺度上的脑功能研究创造了条件[4-6]。目前，主流的神经成像技术包括静息态功能磁共振（rs-fMRI）与锰离子增强的功能磁共振（MEMRI）。

中枢神经系统中的星形胶质细胞由缝隙连接（gap junctions，GJs）构成相互连接的细胞网络，GJS主要由通道蛋白连接蛋白43（Cx43）组成[7]。星形胶质细胞以网络的形式感知神经元的活动，从而调节神经活动并维持脑内环境动态平衡[8]。在某些病理情况下，一个GJS发生断裂，可形成两个Cx43分子构成的半通道，称之为GJs-Cx43解偶联。课题组之前的研究表明，长期异氟醚暴露会导致GJS-Cx43解偶联，导致PND的发生[8]。然而，GJS-Cx43解偶联对大脑不同脑区之间的功能联系的影响仍不清楚。

近日，南京大学医学院附属鼓楼医院的顾小萍教授团队联合张冰教授团队在CNS Neuroscience and Therapeutics（CNSNT）上发表了题为“Enhancement of astrocytic gap junctions connexin43 coupling can improve long-term isoflurane anesthesia mediated brain network abnormalities and cognitive   impariment”的文章，董瑞、吕品和韩玉强为论文共同第一作者，顾小萍教授、张冰教授、夏天娇副教授为论文共同通讯作者。研究发现PND是一种大脑网络障碍，包括与睡眠-觉醒节奏相关的脑区、与背景记忆和恐惧记忆相关的脑区、海马-杏仁核回路、隔-海马回路和内嗅觉-海马回路。通过增加GJs-Cx43的表达可重构PND对星形细胞网络的影响，部分逆转上述回路中的异常。此外，PND病理的主要特征是氧化应激和神经炎症对海马区的损伤。本文的研究表明促进GJS-Cx43的形成也可通过减轻海马区的氧化应激来改善长期异氟醚麻醉所致的认知功能障碍。（拓展阅读：顾小萍团队最新研究成果，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：J Neuroinflammation︱顾小萍课题组揭示星形胶质细胞网络在长时程异氟烷麻醉介导的术后认知功能障碍中的重要作用）

首先，研究人员将C57BL/6小鼠分为三组，对照组（Con+V）、异氟烷麻醉组（Iso+V）和ZP1069给药组（Iso+D）。Con+V未给予任何干预，Iso+V进行了6 h异氟烷麻醉干预以建立PND行为学模型，Iso+D在给予6H异氟烷麻醉后，进行缝隙连接蛋白增强剂ZP1069药物治疗（图1）。行为学结果发现，与Con+V相比，长时程异氟烷麻醉导致了小鼠学习记忆能力在麻醉后第1、3天的显著降低，而在给予ZP1069治疗后，小鼠的学习记忆得到了改善（图2），这提示，利用ZP1069增强GJs-Cx43偶联，可以缓解长时程异氟烷麻醉导致的认知功能障碍。

图1 磁共振成像(MRI)研究中使用的组、治疗和程序的时间图。（图源：Rui Dong et al., CNSNT, 2022）

图2 增强缝隙连接蛋白43偶联可减轻长期异氟醚麻醉所致的认知功能障碍

（图源：Rui Dong et al., CNSNT, 2022）

为了进一步探究PND小鼠不同脑区的活动变化，作者运用了MEMRI探究PND模型下各脑区活动变化（图1 A）。为排除混杂因素的干扰，作者首先分析了小鼠的大脑、丘脑和海马体总体积，均未发现统计学差异（图3 A）。基于体素的MEMRI全脑分析结果提示，长时程异氟醚麻醉引起的全脑信号强度变化具有脑区特异性，不同脑区MEMRI信号强度变化趋势并不完全一致（图4 A-C）。总体而言，Iso+V与Con+V中MEMRI信号强度变化的趋势与Iso+D与Iso+V中的趋势是相反的。

图3 比较小鼠脑体积和MnCl2吸收率

（图源：Rui Dong et al., CNSNT, 2022）

为了更好地了解这些脑区与PND的关系，研究者们基于体素结果提取感兴趣区（region of interest，ROI）进行统计分析。分析结果提示，在3组小鼠之间，28个脑区存在统计学差异（图4 D）。随后，研究者将28个脑区分为4类，I类：反向激活，即增强GJs-Cx43偶联可逆转长期异氟醚麻醉引起的MEMRI信号强度降低；第二类：反向抑制，这意味着长期异氟醚麻醉会引起MEMRI信号强度增强，但增强GJs-Cx43偶联会逆转；III类：激活增强，即Con+V组与Iso+V组MEMRI信号强度无统计学差异，而Iso+D组MEMRI信号强度增加；第四类：无影响，即增强GJs-Cx43偶联对长期异氟醚麻醉引起的MEMRI信号强度变化无影响（图4 D）。这些结果表明，异氟醚引起的认知功能障碍是一个复杂的网络，而不是一种基于区域的疾病，GJS-Cx43解偶联也涉及到多个脑区。

图4 不同干预下锰增强磁共振成像(MEMRI)的体素全脑和基于感兴趣区的分类分析

（图源：Rui Dong et al., CNSNT, 2022）

为进一步了解差异脑区之间的功能连接，研究者们选取MEMRI中差异脑区作为种子区（ROI），并对这些差异脑区运用fMRI进行功能连接分析（图5）。研究结果显示，较Con+V组相比，Iso+V组中线上方有154个连接，中线以下有224个连接，这表明Iso+V组的连接强度显著降低。较Iso+V相比，Iso+D组中线上方有240个连接，中线下方有138个连接，这意味着与Iso+V组相比，Iso+D组提高了脑区之间的功能连接。同时，值得注意的是，与Con+V组相比，Iso+D组也表现出功能连接的增加（中线以上225个连接，中线以下153个连接）。这表明，长期异氟醚暴露可导致FC强度下降，而促进GJS-Cx43偶联可部分逆转长期异氟醚麻醉所致的功能连接异常，并伴有其他脑区的功能连接代偿性改变。

图5 对锰增强磁共振成像(MEMRI)差异信号的脑区进行功能连接分析

（图源：Rui Dong et al., CNSNT, 2022）

海马区被认为是PND病理生理的关键脑区，主要参于学习和记忆的形成。作者发现长时程异氟醚麻醉后，海马区的MEMRI信号强度显著降低。当以海马体为ROI，进行基于ROI的分析时，结果提示：与Con+V组相比，Iso+V组某些区域的功能连接显著降低，并且研究还发现，这些功能连接的降低可被ZP1069逆转（图6）。进一步分析发现，较Iso+V相比，ZP1069除了具有逆转效果，还显著增加部分海马脑区之间的功能连接。上述结果表明，长时程异氟醚麻醉可导致海马区与其他脑区之间的功能连接异常，而这些异常变化可以通过重建GJs-Cx43介导的星形细胞网络来逆转。毫无疑问，这些差异的功能连接对下一阶段的神经环路研究具有重要的意义。

图6 以海马区为种子区的全脑功能连接分析

（图源：Rui Dong et al., CNSNT, 2022）

为了探索GJs-Cx43解偶联可能影响PND小鼠脑网络的潜在机制，作者检测了海马区氧化应激和神经炎症指标的水平（图7 A-E）。结果发现，ZP1069显著增加海马区GJs-Cx43偶联，但不增加总Cx43水平。进一步研究发现，增加海马区GJs-Cx43偶联，可显著逆转海马神经炎症，升高超氧化物歧化酶活性和降低丙二醛与ROS水平。

图7 增加间隙连接连接蛋白43(GJS-Cx43)偶联减轻海马区和原代培养星形胶质细胞的氧化应激和神经炎症

（图源：Rui Dong et al., CNSNT, 2022）

为了进一步探讨异氟醚对GJs-Cx43介导的星形胶质细胞偶联的影响，作者以纯化的原代星形胶质细胞为研究对象。给予原代星形胶质细胞6H麻醉干预后，研究发现，异氟醚处理的原代星形胶质细胞总Cx43显著减少，并表现出明显的GJs-Cx43解偶联，IL-1β和IL-6的升高，超氧化物歧化酶活性显著抑制，丙二醛和ROS的含量显著增加。而给予ZP1069干预后，ZP1069可在不影响总Cx43表达量的情况下，增加了GJs-Cx43，减少IL-1β和IL-6表达，逆转了超氧化物歧化酶活性降低和减少了丙二醛和ROS的含量（图7 F-J）。这些结果表明，长期异氟烷暴露导致GJs-Cx43在原代星形胶质细胞中解偶联，并诱导氧化应激和神经炎症，而通过增加GJS-Cx43偶联来重建星形胶质细胞网络可以减轻异氟醚诱导的星形胶质细胞氧化应激和炎症。

文章结论与讨论，启发与展望

首先，该研究结合磁共振技术、分子生物学、细胞学和动物行为学等多种研究手段，明确了缝隙连接蛋白43（Cx43）介导的星形胶质细胞网络与围手术期神经认知障碍（PND）介导的脑区活动异常之间的关系。既往研究发现星形细胞网络的解偶联导致CA1神经元活性和长时突触可塑性降低[9]，作者认为这可能和星形胶质细胞解偶联出现的氧化应激和神经炎症有关。值得注意的是，既往的临床研究表明丘脑和海马体体积的减少与PND密切相关[10]，然而，在这项研究的结果提示，PND小鼠的全脑、丘脑和海马体的体积没有改变。

在这篇文章中，作者报道了一些受PND影响的脑区，该部分差异脑区似乎可以用来解释异氟烷对动物行为学的影响。例如，既往报道，恒河猴在接受异氟醚麻醉5小时后，观察到亲密社交行为减少，焦虑相关行为增加[11]。作者在PND模型的磁共振结果中同样发现，负责情绪或社会行为的脑区——MEA[12]，在长接受长时程异氟醚麻醉后，MEMRI信号强度显着下降，且无法通过增加缝隙连接（GJs）-Cx43耦合恢复。这表明异氟醚可能通过抑制MEA的活性来影响社会行为，但是，其所采用的神经回路机制需要在后续研究中加以阐明。

总之，作者的研究数据表明，增加GJs-Cx43偶联可以减轻神经炎症和氧化应激，改善长期异氟醚麻醉引起的异常脑功能网络模式，有助于恢复与PND相关的潜在神经回路.这种全面的实验方法还为在中尺度水平上与星形胶质细胞相关的脑功能改变提供了新的见解。

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36153812/

通讯作者：顾小萍（左一）、张冰（左二）、夏天娇（左三）；共同第一作者：董瑞（右三）、吕品（右二）、韩玉强（右一）

（照片提供自：南京大学医学院附属鼓楼医院顾小萍研究团队）

往期文章精选优质科研培训课程推荐【1】单细胞测序与空间转录组学数据分析研讨会（10月29-30日 腾讯在线会议）【2】膜片钳与光遗传及钙成像技术研讨会（2022年10月15-16日 腾讯会议）会议/论坛预告&回顾欢迎加入“逻辑神经科学”【1】人才招聘︱“ 逻辑神经科学 ”诚聘文章解读/撰写岗位 ( 网络兼职, 在线办公)

参考文献（上下滑动阅读） 

1. Evered, L., et al., Recommendations for the Nomenclature of Cognitive Change Associated with Anaesthesia and Surgery-2018. Anesthesiology, 2018. 129(5): p. 872-879.2. Xie, Z., et al., The inhalation anesthetic isoflurane induces a vicious cycle of apoptosis and amyloid beta-protein accumulation. J Neurosci, 2007. 27(6): p. 1247-54.3. Bullmore, E. and O. Sporns, Complex brain networks: graph theoretical analysis of structural and functional systems. Nat Rev Neurosci, 2009. 10(3): p. 186-98.4. Lenk, K., et al., A Computational Model of Interactions Between Neuronal and Astrocytic Networks: The Role of Astrocytes in the Stability of the Neuronal Firing Rate. Front Comput Neurosci, 2019. 13: p. 92.5. Choi, M., et al., Disruption of the astrocyte-neuron interaction is responsible for the impairments in learning and memory in 5XFAD mice: an Alzheimer's disease animal model. Mol Brain, 2021. 14(1): p. 111.6. Wedler, F.C. and R.B. Denman, Glutamine synthetase: the major Mn(II) enzyme in mammalian brain.Curr Top Cell Regul, 1984. 24: p. 153-69.7. Boal, A.M., et al., Astrocyte Networks as Therapeutic Targets in Glaucomatous Neurodegeneration. Cells, 2021. 10(6).8. Dong, R., et al., Connexin 43 gap junction-mediated astrocytic network reconstruction attenuates isoflurane-induced cognitive dysfunction in mice. J Neuroinflammation, 2022. 19(1): p. 64.9. Hösli, L., et al., Decoupling astrocytes in adult mice impairs synaptic plasticity and spatial learning.Cell Rep, 2022. 38(10): p. 110484.10. Huang, C., et al., Exploring Postoperative Cognitive Dysfunction and Delirium in Noncardiac Surgery Using MRI: A Systematic Review. Neural Plast, 2018. 2018: p. 1281657.11. Neudecker, V., et al., Infant isoflurane exposure affects social behaviours, but does not impair specific cognitive domains in juvenile non-human primates. Br J Anaesth, 2021. 126(2): p. 486-499.12. Lymer, J.M., et al., Estrogens and their receptors in the medial amygdala rapidly facilitate social recognition in female mice. Psychoneuroendocrinology, 2018. 89: p. 30-38.

本文完