Nature︱张世成等解析基于蕈毒碱型乙酰胆碱受体的化学遗传工具DREADD的设计原理
化学遗传学是指通过对生物大分子实行改造，使其能和先前无法识别的小分子进行相互作用，从而达到可控和可逆地（伴随加入或除去化合物而启动或中断特定的反应）控制生物大分子的活性，进而特异性地影响生理活动。2007年，Bryan Roth教授实验室利用定向进化的筛选策略，成功获得了可以被药理惰性的化合物氧化氯氮平（Clozapine-N-oxide，CNO）选择性激活的改造蕈毒碱型乙酰胆碱受体（muscarinic acetylcholine receptor，mAChR）的化学遗传操作系统，并命名为DREADD（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs）。该系统具有极低的本底活性，完全丧失对于内源激动剂乙酰胆碱的反应，和能够被在药理学上呈现惰性的化合物CNO高效激活等三个重要特征。其中，偶联Gq信号通路（hM3Dq）和Gi/o信号通路（hM4Di）的DREADD是两种目前最广泛用于神经科学领域的化学遗传操作工具：hM3Dq被用于激活神经元[1]，而hM4Di则被用于抑制神经元活性[2]（图1）。DREADD系统相较于神经科学另一项广泛使用的操作工具——光遗传学，具有非侵入性，无需特殊设备，可以长时间激活或抑制神经元活性，具有较强的医学转化可能等优点；不过也时间分辨率较差等缺点。
此外，DREADD系统还可用于探索在体内特定细胞，组织或者器官中激活特定GPCR下游信号通路所产生的生理效应变化，进而研究不同信号通路在临床药物治疗中作用，开发更具有靶向性的治疗方法。比如，NIDDK的Jürgen Wess教授利用DREADD系统对于糖尿病的发生及药物开发进行了较为系统的研究[3]。由于通常情况下，单一GPCR可能在体内会有多组织表达的特性，而单一给药会造成多组织器官的生理反应。并且，单一GPCR可能还会偶联多种下游信号通路，比如实验室前期已经报道的5-HT5A受体即可偶联Gi1-3、GoAB、G15、β-Arrestin等多条信号通路[4]。而非治疗效果的信号通路被激活则会引起药物的副作用。Roth实验室前期开发的下游信号通路分析平台，TRUPATH [5]，可以有效分析不同药物刺激下的GPCR的下游信号通路，绘制不同药物的偏好性图谱。目前，在hM3Dq的基础上，相继有Gs-DREADD（M3Ds）、G12-DREADD（M3D12）、β-arrestin DREADD（M3D R165L）等信号通路特异的DREADD系统被开发，其他通路特异性的DREADD系统仍有待开发。
然而，作为目前广泛使用的DREADD激动配体（Actuator）CNO在2017年发表的Science文章中被证明不能有效跨越血脑屏障发挥功能，而是其在体内的代谢产物氯氮平（Clozapine）激活了脑中表达的DREADD受体[6]。而Clozapine十分复杂的药理性质（能够结合众多在大脑中高表达的受体），使得其会导致多种多样的副作用[7]。因而开发具有高代谢稳定性，高选择性，高效能的激动配体成为化学遗传学领域的一个重要课题。在后续的研究中，Bryan Roth教授实验室通过与其他实验室合作，相继开发了包括Compound 21和去氯氯氮平（Deschloroclozapine，DCZ）等其他DREADD激动配体化合物。其中，DCZ是目前亲和力最高的，效能最好的激动配体。此外，发现可以激活DREADD受体的已批准或者条件批准的药物对于DREADD系统的临床医学转化也具有重要意义，目前主要有Perlapine和Olanzapine这两种药物被验证可以分别激活hM3Dq和hM4Di。值得注意的是，上述具有极低本地活性和十分优异配体选择性的DREADD系统仅仅通过引入两个位于配体结合口袋附近的单点突变（Y3x33C和A5x461G）便实现了以上效果。然而，DREADD突变如何实现上述效果，一直以来都并不清楚，因而也限制了DREADD系统的进一步改造和应用。
图1 DREADD系统工作模式及hM3Dq, hM4Di结合DCZ或CNO复合物的整体结构
（图源：Zhang, et al. Nature, 2022）
为了进一步阐明DREADD受体选择性激活的分子机制，理解DREADD系统的设计原理，2022年11月30日，美国北卡罗莱纳大学教堂山分校的Bryan Roth教授与马里兰大学的Jonathan F. Fay教授实验室合作在Nature杂志在线发表了题为“Molecular basis for selective activation of DREADD-based chemogenetics”的研究论文。通过对结合激动配体DCZ或CNO的hM3Dq和hM4Di复合物及结合内源配体类似物iperoxo的hM3R复合物等多个高分辨率电镜结构的比较分析，结合相应的生化，药理和分子动力学模拟实验，揭示了DREADD受体丧失本底活性，对内源配体不敏感，和其可以被激动配体激活的分子基础。以上信息将直接促进新型激动配体的后续开发，为构造其他新型DREADD系统提供思路，从而进一步丰富化学遗传操作工具，拓展DREADD系统的应用场景。（拓展阅读：Bryan Roth & Jonathan F. Fay团队最新进展（其中张世成博士为第一作者），详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：NSMB | 从药理、结构到配体发现：血清素5A亚型受体的系统研究）
尽管在此之前，已有多个mAChR家族受体（M1-M5）的激活态和非激活态结构被报导，然而其中的激活态结构均结合内源配体乙酰胆碱（Acetylcholine，ACh）的类似物iperoxo。该配体分子在化学结构上与Clozapine及其类似物有很大不同（图1）。在受体结构上，相比于其他生物胺家族受体，mAChR家族的一个显著特征是其位于正构结合（Orthosteric binding pocket）位点上方，彼此相互作用形成盖子结构（酪氨酸盖，Tyrosine lid）的三个保守的酪氨酸（Y3x33，Y6x51和Y7x38）。这三个酪氨酸不仅可以直接和内源配体ACh或其类似物的正电荷形成pi-cation的强相互作用，而且也可以通过覆盖在其上方增强ACh或iperoxo在正构口袋里的结合（图2）。因此，DREADD突变直接破坏了该酪氨酸盖的结构，导致了受体对于ACh及其类似物亲和力的丧失。此外，该酪氨酸盖结构同时也介导了TM3-TM6-TM7胞外端的相互作用网络，因而其可能在维持受体本底活性中扮演重要角色。由于尚未有不结合配体和传感器蛋白（Transducer）的mAChR家族受体结构报导，作者将此次解析的hM3R-iperoxo结构与Alphafold2中预测的hM3R结构进行了比对，发现这三个酪氨酸以及D3x32和Y7x42的构象在二者之间高度一致。且相关的功能实验也表明，在引入DREADD突变后，hM4R针对Gi的本底活性几乎完全丧失。以上结果也很好地解释了，为何mAChR家族的激动剂多为ACh类似的狭长化学结构（为了避免破坏稳定的酪氨酸盖结构）（图2）。
相应地，该家族的拮抗剂（antagonist）包括Clozapine、QNB、Tiotropium等均有较大的环状结构。通过结构比对发现，上述拮抗剂的环状结构会与激活状态受体中的酪氨酸盖有明显的空间位阻。比如，由于QNB与Y3x33侧链的空间位阻，导致了其环状结构朝TM5/6方向的弯曲和偏移，继而使得TM5和TM6在胞外端外移（图2）。而DREADD突变Y3x33C则直接消除了这一位阻影响，让DCZ或CNO的三环结构，在不影响TM5/6的位置构象的情况下，有足够的空间结合在正位口袋（图2）。该想法也被突变体Y3x33A同样可以被DCZ有效激活的实验结果所证实。而分子动力学模拟实验还揭示了Y3x33可以与ECL2上I45x52等疏水氨基酸相互作用，形成疏水簇，从而进一步稳定酪氨酸盖的构象，促进下方的内源配体及其类似物结合在正位口袋中。该发现也与已经报导的多种mAChR家族的正向别构调节分子（Positive allosteric modulator，PAM）的结合位点位于ECL2和TM6，TM7之间相一致，即通过稳定该部分的构象来帮助下方正构口袋中小分子配体的高效结合。
图2 DREADD系统选择性激活的分子机制
（图源：Zhang, et al. Nature, 2022）
在以上识别模式分析的基础上，结合已发表的结构数据，作者进一步分析，推测认为传统的mAChR家族拮抗剂QNB和Tiotropium可能能够激活DREADD受体。随即的功能实验验证了该想法，作者发现QNB和Tiotropium在BRET2实验中均能够部分激活hM4Di，而不能激活hM3Dq（图3）。在经典的cAMP累积（针对Gi/Gs偶联受体）和钙流实验（针对Gq偶联受体）中，表现出同样的特征，即QNB和Tiotropium可以完全激活hM4Di，而不能激活hM3Dq。这些数据提示，未来针对QNB或者Tiotropium的改造可以提供有效的亚型选择性的激动配体。而针对其选择性的机制，作者则通过对偶联G蛋白的hM3Dq和hM4Di受体结构的分析，发现相对于hM4Di，hM3Dq的TM6螺旋在激活后会发生更大的外移，提示其激活所需能量可能更高。这一发现，也与几乎所有的激动配体对于hM4Di受体都有相比于hM3Dq更高的效能（potency）的现象相一致。
图3 QNB和Tiotropium等mAChR的拮抗剂可以选择性激活hM4Di
（图源：Zhang, et al. Nature, 2022）
综上，该研究深入探索了DREADD系统选择性识别激动配体的分子机制，为开发下一代激动配体提供了结构基础，使得发展化学结构，药理，药代药动等性质多样化的激动配体成为可能。除此之外，本文对mAChR家族的偶联选择性等问题也进行了一定的分析和讨论。而且，尽管Clozapine可以结合众多在大脑内高表达的受体，目前仍未有其结合相关受体的结构被报导，该研究同样也对于了解Clozapine的受体结合模式和药理性质提供了重要帮助。不过，文章中并未对常用的融合改造策略对于DREADD下游偶联信号通路产生的影响进行分析，也缺少对于激动配体的改造方向的讨论等内容。相信在后续的研究中，作者能够进一步拓展完善DREADD系统，使其在基础研究和临床治疗中发挥更大的可能。
Roth实验室的博后张世成和Ryan Gumpper为共同第一作者，其中张世成负责整个实验的设计，复合物的纯化，结构解析，大部分药理功能实验和数据图表的分析准备，以及文章的写作；Ryan Gumpper负责文章中小分子对接和分子动力学模拟部分的实验和数据分析。最后，非常欢迎对于神经生物学工具开发，化学遗传操作工具改造，及文章相关内容如有兴趣或疑问，来信与作者交流（hustzsc@email.unc.edu）。
第一作者简介（上下滑动阅读）
张世成博士于2017年在中科院上海生物化学与细胞生物学研究所获得博士学位，后在北卡罗莱纳大学教堂山分校的著名神经药理学家Bryan Roth教授的实验室进行博士后研究至今。期间，以第一作者或者共同第一作者在Nature、Nature Structural & Molecular Biology、Neuron, Nucleic Acids Research和Cell Research等国际著名期刊上发表多篇原创长文研究（详见https://www.researchgate.net/profile/Shicheng-Zhang-9）。欢迎希望招募结构生物学，分子药理学，神经药理学和先导药物发现等方向的学校单位联系hustzsc@email.unc.edu 。
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1. G. M. Alexander et al., Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron 63, 27-39 (2009).
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