Nat Commun︱叶克强团队揭示ApoE4和FSH协同诱发阿尔兹海默症的机制

“逻辑神经科学”和千奥星科联合开展主题为【光遗传学与遗传编码钙探针和神经递质探针工作原理及应用】和【在体成像技术在神经科学研究的基础与应用】的【神经环路主题系列】技能培训班（第二期）将于2023年10月28-30日（周六至周一）在南京举办。主讲人：复旦大学陈明研究员和北京大学董辉博士（博士后，合作导师李毓龙教授）。讲师示教与学员实际操作+学员自主巩固学习、助教全程答疑与协助。“理论知识，操作技能，科研思维”综合学习和提升。欢迎报名咨询，参加学习。内容详见（点击阅读）：神经环路主题系列︱神经活动的光学控制与记录（第二期）

撰文︱叶克强，王蒙蒙

审阅︱王思珍

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种进行性神经退行性疾病，其特征是记忆、注意力、语言和日常生活活动功能障碍。病理特征包括细胞外老年斑块，主要由Aβ多肽组成，以及神经元内神经原纤维缠结（NFT），主要由高磷酸化和截短的Tau组成。AD大脑表现出广泛的神经退行性变，与慢性炎症有关。研究表明大约2/3的AD患者是女性。流行病学研究表明APOEε4等位基因与女性之间存在性别特异性关联。与APOEε3等位基因纯合的女性相比，具有一个APOEε4等位基因的女性患AD的风险增加了四倍，两个ε4等位基因的女性患AD风险增加了15倍。女性ε3/ε4等位基因携带者通常比男性ε3/ε4携带者出现早发、年龄相关性下降更快、认知能力恶化更严重[1]。

卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone，FSH）是垂体前叶促性腺细胞分泌的一种促性腺激素，是男性和女性生殖功能的中枢调节因子。FSH结合并激活FSH受体（FSHR），诱导下游信号转导。FSH在生殖中具有主要功能，它诱导雌性产生雌激素，并调节雄性的精子发生[2]。即使血清雌激素水平保持在正常范围内，早期更年期过渡也与血清FSH水平的急剧上升有关[3]。大约在更年期前两三年，当血清雌激素水平正常时，血清FSH水平开始升高。FSH通过增加破骨细胞的骨吸收来调节骨量[9]，并调节体脂[5]。阻断FSH对其受体的作用不仅可以增加骨量[6]，并降低体脂[5]。这些数据提供了一个新的视角，FSH可能是围绝经期的一种重要激素，它表现出与雌激素作用平行的替代机制。围绝经期晚期的卵巢功能衰竭与血清FSH的急剧升高有关，这与骨丢失和内脏肥胖的发病率最快相吻合[7]。最近流行病学研究揭示了手术更年期与认知能力下降和AD病理之间的关系[8]。例如，患有AD女性的FSH水平明显更高[9]。在更年期开始前接受双侧卵巢切除术的女性患认知障碍或痴呆的风险长期增加。单侧卵巢切除术，无论是否同时进行子宫切除术，都会增加认知能力下降或痴呆的风险[10,11]。

C/EBPβ作为转录因子, 参与细胞能量代谢、细胞增殖和分化[12,13]，在炎症中起关键作用[14]。C/EBPβ在AD患者的大脑增强[15,16]，且Aβ刺激经胶质细胞中C/EBPβ的激活[17]。团队近些年研究表明C/EBPβ调控AEP（又称δ-分泌酶）表达，剪切APP和Tau，加重AD病理[18-21]。值得注意的是，C/EBPβ在FSH刺激下介导卵巢颗粒细胞中的类固醇生成性急性调节蛋白（StAR）和前列腺素内过氧化物合成酶2基因[22-24]。另一方面，FSH诱导各种C/EBP亚型并激活Sertoli细胞中C/EBPβ的转录活性[25]。最近，本团队报道了FSH激活其在大脑中的FSHR，使女性更容易患AD，阻断FSH可改善患有AD小鼠的认知能力[26]。因此，在目前的工作中，我们检验了ApoE4和FSH可能通过激活C/EBP/AEP使女性额外易患AD的假设。

2023年10月5日，叶克强课题组在《自然通讯》（Nature Communication）上发表了题为“FSH and ApoE4 contribute to Alzheimer’s disease-like pathogenesis via C/EBPβ/δ- secretase in female mice”的研究论文，提出C/EBPβ/AEP是ApoE4和女性协同增加AD风险的机制。熊婧为论文第一作者，叶克强教授为论文通讯作者。在此项研究中，作者发现，ApoE4和FSH协同激活C/EBPβ/δ-分泌酶途径，介导APP和Tau蛋白水解断裂，刺激Aβ和神经原纤维缠结。抗FSH抗体治疗可改善雌性ApoE4 TR小鼠卵巢切除引起的AD样病变和认知缺陷。FSH给药促进了年轻雄性和雌性ApoE4 TR小鼠的AD样病变。此外，FSH刺激ApoE4 TR小鼠的AD样病变和认知缺陷，但不刺激ApoE3 TR小鼠。因此该文研究结果表明，ApoE4和FSH协同激活C/EBPβ/AEP信号介导了糖尿病诱发的AD。（拓展阅读：叶克强课题组相关研究进展，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：Cell︱叶克强/李丹/张振涛等合作报道新型示踪剂可特异识别帕金森病重要致病蛋白；Nat Commun︱叶克强团队发现TrkB激动剂前药-R13可抑制骨流失；Mol Psychiatry︱叶克强课题组揭示炎症激活的C/EBPβ/AEP信号通路介导高脂饮食诱发的糖尿病及阿尔兹海默症；Mol Psychiatry︱叶克强课题组揭示C/EBPβ/AEP信号通路介导了动脉粥样硬化及其诱发的阿尔兹海默症）

为了研究ApoE4是否与FSH激活C/EBPβ/AEP途径有关，使用重组人FSH（30 ng/ml）在rApoE3或rApoE4重组蛋白存在的情况下刺激原代神经元培养。与对照组相比，FSH显著提高C/EBPβ以及活性AEP，且APP N585和Tau N368剪切片段增多，其中Tau N368片段化与显著的Tau磷酸化AT8密切相关；相反，FSHR和LRP1（ApoE受体）保持恒定（图1A，B）。FSH显著增加了AEP蛋白酶活性，rApoE4而不是rApoE3进一步增强了FSH的刺激作用（图1C）。免疫荧光（IF）染色验证了IB观察到的FSH激活C/EBPβ/AEP信号传导，导致APP和Tau蛋白水解断裂，与Aβ以及AT8升级，且ApoE4增加了FSH的作用（图1D-F）。与这些发现一致，LDH测定显示，与PBS相比，FSH显著提高了神经毒性，ApoE4而不是ApoE3进一步增强了神经毒性（图1G）。因此，ApoE4和FSH额外激活C/EBPβ/AEP途径，并触发APP和Tau蛋白的剪切，导致Aβ和p-Tau增加和神经元细胞死亡。

此外，ApoE主要由大脑中的星形胶质细胞产生。星形胶质细胞分泌大量脂化ApoE。为了研究脂质化ApoE对C/EBPβ/δ-分泌酶途径的影响以及与FSH的相互作用，作者使用HEK293T细胞产生脂质化ApoE3和ApoE4。结果表明，脂化ApoE4与FSH的相互作用对C/EBPβ/δ-分泌酶途径的影响与rApoE4相似。

为了进一步探索FSH和ApoE4的联合作用，作者使用了由ApoE3/E3或ApoE4/E4-iPSC细胞诱导的人类原代神经元。结果表明，FSH使E3/3神经元的AEP酶活性逐渐升高；而ApoE 4/4神经元的AEP活性显著更高，FSH以浓度依赖性方式进一步升高）。因此，FSH刺激人类神经元C/EBPβ/AEP信号的激活，且ApoE4增强了FSH的刺激作用。

图1 FSH和ApoE4协同激活C/EBPβ/AEP信号通路

（图源：J. Xiong et al., Nat Commun, 2023）

为了探讨FSH是否加速ApoE4 TR小鼠的AD病理，我们向4个月大的雌性和雄性小鼠腹膜内（i.p.）连续注射FSH（5IU/d）3个月。与PBS相比，FSH使雄性和雌性ApoE4 TR小鼠大脑中C/EBPβ及其下游靶AEP的表达显著升高。且FSH也强烈刺激AEP的激活， APP N585、Tau N368和p-Tau水平显著升高（图2A和B）。定量分析显示，在男性和女性大脑中，FSH都能显著提高AEP酶活性（图2C）。免疫组织化学（IHC）显示，FSH在两性的海马和皮层中增加p-Tau AT100信号（图2D和E）。IF分析显示p-Tau AT8/Tau N368共染色也显示出与IHC结果一致的相似模式。银染色证实了女性皮层区域中的神经元内聚集性内含物比男性更强的（图2F和G）。此外，T22（聚集性Tau病理的生物标志物）和AT8共染色也证实，FSH强烈增强了雄性和雌性小鼠大脑海马中的p-Tau及其原纤维化（图2H）。GFAP和Iba-1染色显示，FSH分别使大脑中的星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化升级（图2I）。高尔基染色表明，FSH显著减少了两性海马神经元中的树突棘（图3A）。IB分析显示，两性的突触蛋白也都减少了（图3B和D）。因此，这些发现支持FSH治疗触发雄性和雌性小鼠ApoE4 TR大脑的突触变性。此外，VGluT1和GAD67染色表明，FSH处理减少了两性的兴奋性神经元和抑制性GABA能中间神经元。因此，电子显微镜（EM）分析显示，FSH有力地减少了两性的突触（图3C）。恐惧条件测定显示，FSH显著降低了雌性ApoE4 TR小鼠而非雄性小鼠的情境和提示恐惧条件（图3E），与皮层中突出的Tau病理一致。行为学实验表明FSH刺激后的小鼠表现较PBS差，但无统计学显著性（图3F）。综上，FSH处理促进了雄性和雌性ApoE4 TR小鼠的AD发病，并导致雌性小鼠的记忆缺陷。

图2 FSH在雄性和雌性ApoE4 TR小鼠中触发C/EBPβ/δ-分泌酶信号传导和AD病理

（图源：J. Xiong et al., Nat Commun, 2023）

图3 FSH在雄性和雌性ApoE4 TR小鼠中触发AD病理和认知功能障碍。

（图源：J. Xiong et al., Nat Commun, 2023）

ApoE3和ApoE4小鼠在不同年龄的血清FSH水平没有差异。为了研究FSH是否以ApoE4依赖性的方式优先刺激AD病理，作者采用ApoE3 TR和ApoE4 TR雌性小鼠（4个月大），连续用FSH治疗3个月。结果表明，与ApoE3 TR小鼠相比，FSH选择性加重ApoE4 TR小鼠的AD病理（图4）。

图4 FSH处理加速ApoE4小鼠的AD病理和认知缺陷，但不影响ApoE3 TR小鼠。

（图源：J. Xiong et al., Nat Commun, 2023）

卵巢切除术（OVX）会破坏女性性激素，并使FSH水平升高。FSH特异性抗体阻止FSH与其受体结合，拮抗FSH/FSHR信号[6]。团队近期研究表明，FSH抗体阻断神经元中的p-C/EBPβ/ AEP信号传导，且抗FSH降低的OVX在3xTg小鼠中引发AD病理[26]。为了探讨OVX刺激的FSH是否与ApoE4介导的AD发病机制有关，我们对雌性ApoE3 TR和ApoE4 TR小鼠（4个月大）进行了OVX手术。ApoE3 TR小鼠没有显著的AD病理和认知功能障碍。因此，半数ApoE4 TR小鼠用FSH抗体或对照IgG（腹膜内注射）。免疫印迹显示，与假对照相比，OVX后雌性ApoE4 TR小鼠大脑中C/EBPβ的表达增加，下游靶AEP也增加。因此，APP N585、p-Tau和Tau N368升高，与FSH水平升高相关；用特异性抗体阻断FSH缓解了这些现象。与假手术相比，OVX显著增加了大脑中的FSH。有趣的是，在OVX处理的小鼠中，GAD67和vGluT1水平均明显降低，抗FSH可减轻这种情况（图5A-B）。OVX也增加了AEP的酶活性，而FSH中和则显著降低了活性（图5C）。定量分析表明Aβ40和Aβ42浓度在OVX处理的小鼠中显著升高，其受到FSH抗体的强烈抑制（图5D）。IF共染色显示，OVX强烈诱导Tau N368信号，并伴有海马中强大的p-Tau AT8活性，这些活性被抗FSH Ab降低（图5E和F）。与这些发现一致，银染色也验证了OVX在海马体中触发了密集的蛋白质内含物（图5G）。采用人类AD脑作为阳性对照，发现在TH-S和S1（可溶性1）级分中都可检测到不溶性AT8阳性p-Tau蛋白，但它们在P2（颗粒2）级分高度富集。相反，在sham-ApoE4-TR小鼠中没有任何明显的不溶性p-Tau，而在OVX处理的小鼠的P2组分中存在分布，该组分在抗FSH处理后被根除（图5J）。因此，这些发现表明抗FSH有效地减轻了OVX诱导的ApoE4 TR小鼠的Tau病理。一致地，GFAP和Iba-1共染色显示OVX触发的广泛星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化，抗FSH减轻了这些影响（图5H&I）。高尔基染色显示OVX后海马神经元的树突棘减少，FSH抗体减轻了这种减少（图5K）。EM分析显示，OVX使ApoE4 TR小鼠的突触显著减少，OVX被抗FSH挽救。与这些发现相吻合，免疫印迹显示，OVX降低了突触蛋白，包括PSD95、突触素和突触素，这些蛋白在抗FSH治疗后恢复（图5L）。水迷宫认知行为测试表明，OVX诱导了显著的学习和记忆障碍，FSH抗体挽救了这种障碍（图5M）。总之，这些数据支持OVX以高FSH水平模拟更年期，并在ApoE4 TR小鼠模型中诱导记忆丧失，并且用其抗体阻断FSH可以减轻OVX的影响。因此，FSH介导雌性ApoE4 TR小鼠OVX刺激的AD发病机制。

图5 卵巢切除通过FSH触发雌性ApoE4 TR小鼠的C/EBPβ/δ分泌酶和AD病理

（图源：J. Xiong et al., Nat Commun, 2023）

绝经后妇女的雌激素治疗被认为对早发和晚发AD都有益[27，28]，尽管关于雌激素替代疗法（ERT）对AD的影响结论不易。由于FSH和雌激素之间存在反馈调节回路，雌激素水平的降低可能会影响AD病理，因此必须保持正常的雌激素水平，以排除雌激素对C/EBPβ/AEP信号的影响。因此，作者在ApoE4 TR雌性小鼠中进行了OVX手术，并通过外源性补充雌激素（OVX+E2）来维持正常的E2水平。在这种条件下，还向小鼠注射外源性FSH（OVX+E2+FSH），以将FSH水平提高到与OVX组相当的浓度。接受FSH的OVX+E2+FSH小鼠不仅表现出更高的FSH水平，而且表现出正常的E2水平，这与围绝经期妇女的特征相似。正如预期的那样，与假对照相比，OVX手术在雌性ApoE4 TR小鼠中诱导了明显的子宫萎缩，这在E2存在的情况下得到了缓解。OVX处理的小鼠血清中FSH浓度显著升高，而雌二醇水平显著降低。与OVX组相比，OVX+E2小鼠的C/EBPβ/AEP信号传导降低，在（OVX+E2+FSH）组中补充FSH逆转了这些事件（图6A和B）。AEP酶活性测定反映了IB中的活性AEP水平（图6C）。随后，ELISA定量显示Aβ40和Aβ42个重复的APP N585碎片化活动（图6D）。因此，这些发现支持OVX诱导的FSH而不是E2缺乏是C/EBP/AEP信号传导激活和下游AD病理效应的原因。IF显示Tau N368/AT8共染色活性与IB观察结果相匹配，随FSH浓度振荡（图6E）。一致地，与假手术组或OVX+E2组相比，AT8/T22共染色在OVX组和（OVX+E2+FSH）组中均显示出更高的T22活性，再加上强大的AT8信号（图第6F段）。银染色也证实了OVX在海马中引起的蛋白质内含物，这些内含物被E2的补充所减弱。在（OVX+E2+FSH）组中引入外源性FSH部分恢复了蛋白质聚集（图6E）。此外，GFAP/Iba-1共染色也验证了OVX诱导的FSH介导的星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化（图第6G段）。高尔基染色显示，与假手术组相比，OVX处理的雌性ApoE4 TR小鼠表现出显著减少的突触树突，（OVX+E2）小鼠的突触树突增加。同样，补充FSH显著导致（OVX+E2+FSH）小鼠的树突棘减少（图6H）。此外，EM还证明，OVX诱导的FSH而不是E2缺乏是OVX引起的雌性ApoE4 TR小鼠突触退化的原因。与这些观察结果一致，包括PSD95、突触肽和突触肽在内的突触蛋白的IB表现出类似的波动模式（图第6I段）。因此，在ApoE4 TR小鼠中，OVX触发的FSH引发的认知缺陷在（OVX+E2）小鼠中明显减轻。再次，外源性FSH的引入恢复了（OVX+E2+FSH）小鼠的记忆功能障碍（图6J）。总之，这些研究有力地支持FSH或卵巢切除术，独立的雌激素，通过激活C/EBPβ/AEP触发AD病理和认知缺陷通路。

图6 雌性ApoE4 TR小鼠卵巢切除诱导FSH而非雌激素引发AD病理和认知缺陷

（图源：J. Xiong et al., Nat Commun, 2023）

在FSH存在的情况下，神经元而非星形胶质细胞衍生的ApoE4对AD病理学至关重要ApoE可以在神经胶质细胞、神经元和中枢神经系统中的其他类型的细胞中产生。目前尚不清楚在胶质细胞或神经元（或两者）中产生的ApoE4是否对FSH对AD病理的额外影响很重要。为了解决这个问题，使用AAV9 syn-sh APOE病毒或AAV5-gfabc1d-sh-APOE病毒在OVX前分别敲低海马神经元或星形胶质细胞中的APOE表达（图第7C）。发现神经ApoE而非胶质ApoE的缺失显著降低了C/EBPβ/OVX触发的AEP信号传导，导致APP N585和Tau N368片段的抑制（图7A和B）。这导致AT8信号减少和AEP酶活性降低（图第7D）。正如预期的那样，包括PSD95、突触素和突触素在内的突触蛋白水平在OVX下同时减弱，与胶质细胞ApoE根除相比，在用神经ApoE缺失预处理的小鼠中恢复（图7A和B）。与这些观察结果一致，EM分析显示，OVX手术引起了明显的突触损失，其通过神经而非神经胶质ApoE耗竭而减轻。IF染色显示，病毒在海马中显著降低了神经和胶质细胞ApoE水平（图第7C段）。IF共染色表明，与胶质细胞ApoE耗竭相比，当神经ApoE缺失时，OVX刺激的AT8和Tau N368活性基本上被消除。这些事件也通过神经内Tau包涵体的银染色进行了验证（图7E&F）。结果，当神经ApoE敲除时，OVX触发的GFAP和Iba1染色信号都被强烈抑制（图7G&H）。高尔基体染色显示，与假对照组相比，OVX在OVX上引发了显著的树突棘丢失，这通过海马中的神经而非神经胶质ApoE 的敲除得到了显著改善。水迷宫认知测定显示，与神经胶质ApoE敲低组相比，神经ApoE的失活恢复了认知功能（图7IE）。因此，这些发现表明，神经元中的ApoE对于FSH对AD病理的额外影响要重要得多。

图7 神经元而非胶质细胞ApoE4和FSH共同促进AD病理

（图源：J. Xiong et al., Nat Commun, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

尽管性别对AD流行病学的影响目前是深入研究的主题，但性别特异性病理性AD表型的概念在很大程度上尚未被探索。在本研究中，结果表明FSH和ApoE4额外激活神经元C/EBPβ/AEP信号传导（图1）。长期以来，人们认为FSH在性腺组织中发挥作用，主要局限于睾丸中的支持细胞和卵巢中的颗粒细胞；而其同源受体FSHR在多种性腺外组织中表达（包括内皮细胞、单核细胞、发育中的胎盘、骨骼和脂肪）[29]。作者已经证明FSHR在大脑中的神经元中表达[26]。为了评估FSH升高是否加速AD病理的发生，作者对年轻的雄性和雌性ApoE4 TR小鼠都给予FSH，并发现FSH激活C/EBPβ/AEP信号传导，与载体对照相比，显著促进两性大脑中的NFT病理（图2）。值得注意的是，这些作用选择性地发生在ApoE4而不是ApoE3 TR小鼠身上（图3）。此外，采用卵巢切除术来提高ApoE4 TR小鼠的FSH水平，并揭示了相同的可证明的AD病理，这些病理通过其特异性抗体中和FSH而被有力地消除（图4和5）。因此，FSH给药会严重损害雄性和雌性小鼠的认知功能，而抗FSH治疗可有效改善卵巢切除诱导的认知障碍（图4和5）。值得注意的是，OVX小鼠的游泳速度与其他组略有不同。先前的研究表明，更年期过渡使女性肌肉力量和运动功能早期下降。肌肉抽搐力增强与FSH水平呈负相关（Pesonen等人，2021，21133）。与月经暂停的女性一样，OVX雌性小鼠表现出运动功能受损，因为游泳速度异常低于假手术组或OVX-FSH-Ab组（图5I和6J）。可以想象，异常的学习行为曲线可能与奇怪的运动功能障碍有关，而运动功能障碍与FSH水平升高有关。此外，为了消除雌激素缺乏的潜在影响，OVX处理的小鼠补充外源性E2，以与Sham对照相比保持相似的E2水平。在这些条件下，由于垂体的E2反馈，内源性FSH水平也稳定。采用这种方法，作者可以在不改变E2水平的情况下通过外源性FSH来控制FSH水平。作者数据支持OVX诱导的FSH而非雌激素缺乏介导C/EBPβ/AEP信号传导，归因于ApoE4 TR小鼠的AD发病机制（图6）。不同来源的ApoE4是否对FSH对AD病理的额外影响，结果表明神经元中的ApoE对于FSH对AD病理的增强影响要重要得多（图7）。

总之，本文研究结果提供了证据，支持FSH和ApoE4通过激活C/EBPβ/AEP信号通路共同介导女性AD的发病机制。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-42282-7
通讯叶克强（照片提供自：叶克强实验室）

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本文完