NPP︱叶克强团队发现靶向抑制AEP能够有效治疗散发性AD小鼠的病理症状

【更新】：为了进一步完善和提升平的学术特色，为了有序规划、进行和实现未来战略性的发展与目标，即日起，“岚翰生命科学”微信公众号的所有业务将逐步过度并最终全部迁移到姊妹微信公众号“岚翰学术快讯”。2024年1月1日零时起，“岚翰学术快讯”账号将全新且长久运营，并将更名为“岚翰生命科学”。原“岚翰生命科学”账号则将逐渐停止相关内容的更新，另做它用。诚挚欢迎大家继续关注、支持和喜欢“岚翰学术快讯”：

撰文︱钱政江，叶克强

责编︱王思珍

阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的痴呆症类型，该病发病隐匿，病程较长，呈进行性、加重性改变，是人类面临最具挑战性的重大疾病之一。AD的主要病理特征包括由Aβ多肽在细胞外沉积形成的老年斑块（senile plaque），以及由高度磷酸化和截短的Tau病理蛋白在神经元内形成的神经原纤维缠结（neurofibrillarytangle，NFT）。AD的发病多见于65岁以后的老年人，伴随认知障碍、记忆失衡和行为异常等症状。随着人口老龄化的加剧，AD患者数量日益增长，形成严重的社会和经济负担。我国约有1000万AD患者，约占世界AD患者总人口的20%。然而，目前AD尚无有效的治疗方法，临床上使用的药物包括胆碱酶（cholinesterase）抑制剂或NDMA受体拮抗剂等只能轻度缓解AD的临床症状；而靶向淀粉样斑块和磷酸化Tau蛋白的新药开发虽有进展[1, 2]，但伴随许多争议，疗效也不尽如人意。因此针对AD的治疗急需新靶点和新药物开发。

叶克强教授团队长期致力于AD发病机制与小分子药物的研究，并原创性提出：CCAAT-增强子结合蛋白（C/EBP）/天门冬氨酸内肽酶（AEP）通路的激活是导致神经退行性疾病的核心推动因素。该团队的大量研究表明，C/EBP/AEP信号通路涵盖了AD发病的多种假说，包括Aβ、Tau蛋白以及长期慢性炎症假说等，且该通路在生物学时间上更早期和系统原理上更上游[3]。基于这一理论，该团队通过一系列化合物的筛选、验证，获得能够有效抑制AEP活性的小分子化合物#11[4]，并通过进一步优化获得#11A [5]。此外，研究团队发现C/EBPβ能够调节ApoE4的表达，而ApoE4又能反馈促进C/EBPβ的激活，从而进一步加剧AD的发生发展[6, 7]。基于此，该团队建立了Thy1-ApoE4/C/EBPβ转基因的散发性AD小鼠模型，不携带AD形成相关的任何突变基因，但随着年龄的增加小鼠内源性Aβ和Tau病理蛋白聚集，进而形成AD相关的病理特征[8]。因此，在本研究工作中，叶克强教授团队进一步分析了小分子化合物 #11A对Thy1-ApoE4/C/EBPβ转基因散发性AD小鼠的治疗作用[9]。

2023年11月29日，深圳理工大学（筹）生命健康学院生物系主任叶克强教授团队联合中国科学院深圳先进技术研究院罗茜研究员在Neuropsychopharmacology（NPP）杂志发表题为“Inhibition of asparagine endopeptidase (AEP) effectively treats sporadic Alzheimer’s disease in mice”的研究论文，阐述了通过口服小分子化合物#11A特异性靶向抑制AEP的性，能够有效抑制散发性AD小鼠模型的病理特征。钱政江博士为论文第一作者，叶克强教授和罗茜研究员为共同通讯作者。在此研究中，作者通过对#11A药代动力学（pharmacokinetics，PK）和药效动力学（pharmacodynamics，PD）的表征，以及利用口服的方式持续处理散发性AD小鼠模型开展疗效研究，最终发现#11A靶向抑制AEP活性能够有效改善AD的病理发生。（拓展阅读：叶克强课题组相关研究进展，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：Nat Commun︱叶克强团队揭示ApoE4和FSH协同诱发阿尔兹海默症的机制；Cell︱叶克强/李丹/张振涛等合作报道新型示踪剂可特异识别帕金森病重要致病蛋白；Nat Commun︱叶克强团队发现TrkB激动剂前药-R13可抑制骨流失；Mol Psychiatry︱叶克强课题组揭示炎症激活的C/EBPβ/AEP信号通路介导高脂饮食诱发的糖尿病及阿尔兹海默症；Mol Psychiatry︱叶克强课题组揭示C/EBPβ/AEP信号通路介导了动脉粥样硬化及其诱发的阿尔兹海默症）

为了研究#11A是否具有成药性，研究人员首先对#11A 的PK参数进行表征，通过口服和静脉注射的给药方式处理CD1小鼠，并在处理后不同时间点收集脑组织和血液样本，利用LC-MS/MS分析#11A的浓度（图1A）。结果表明：静脉注射给药方式中，#11A在血液和脑组织中浓度随着时间延长逐渐降低（图1C），血液和脑组织t_1/2分别为1.31 h和1.63 h （图1E）；口服给药方式中，#11A在血液和脑组织中浓度分别在1.3 h和1.0 h达到最高，分别为102.78 ng/mL和27.01 ng/mL（图1D和E）；而#11A生物利用度达到80%（图1E）。这些结果表明，小分子化合物#11A具有较高的口服生物活性以及入脑效率。

图1. 口服和静脉注射给药处理后#11A的PK参数表征

（图源：Z. Qian et al. NPP, 2023）

#11A是AEP酶的特异性小分子抑制剂，为探究口服#11A后是否发挥功效，作者进一步对#11A的PD进行分析。研究人员分别利用了家族遗传突变的AD动物模型，包括APP/PS1 和Tau P301S小鼠，以及散发性AD动物模型Thy1-ApoE4/C/EBPβ小鼠进行研究。通过口服不同剂量的#11A（3.5, 7.5, 15 mg/kg），给药处理2h后收集小鼠血液和脑组织进行分析。研究结果表明：在三种AD小鼠模型中，#11A在血液和脑组织中的浓度呈现处理浓度依赖性的增加，而AEP在脑组织中活性被浓度依赖性的抑制，同时AEP下游的酶切底物后产生片段包括Tau N368，APP N585以及APP C586等也随着#11A 处理浓度的增加逐渐降低。利用单分子免疫分析技术（Single-molecule Array，Simoa）进一步在脑脊液和血液中验证了这些结果。图2以Thy1-ApoE4/C/EBPβ小鼠为例，展示了口服不同浓度#11A处理2h后，分析#11A对AEP酶活及其下游底物片段产生的影响。因此，上述结果表明，#11A能够特异性的抑制AEP的活性，降低其下游酶切底物片段的产生，并表现良好的PK/PD关系。

图2. 口服#11A处理Thy1-ApoE4/C/EBPβ小鼠对AEP活性及其下游底物片段的影响

（图源：Z. Qian et al. NPP, 2023）

为进一步探究#11A是否有效延缓Thy1-ApoE4/C/EBPβ小鼠的AD病理进程，研究人员利用3月龄的Thy1-ApoE4/C/EBPβ小鼠，通过口服#11A（7.5 mg/kg）方式进行连续给药处理3个月，然后对小鼠行为学以及AD相关病理特征的分析。研究结果发现，#11A连续给药处理能够有效抑制AEP的酶活性，及其下游产生的酶切底物片段。利用PET CT成像分析发现，#11A处理能够有效抑制A在小鼠脑内的沉积（图3A和B），并通过脑片的免疫染色以及ELISA分析进一步确认（图3C-E）。此外，对Tau病理特征分析发现，#11A处理能够显著降低Tau蛋白的磷酸化程度和聚集（图3F-K）。

图3. #11A连续口服处理Thy1-ApoE4/C/EBPβ鼠对Aβ和Tau蛋白病理特征的影响

（图源：Z. Qian et al. NPP, 2023）

利用Western blot以及免疫染色分析发现，连续的#11A给药处理能够明显增强突触相关蛋白（图4A和B），抑制神经元的凋亡（图4C和D）。利用水迷宫和新物体识别的行为学分析发现，连续的#11A给药处理能够明显改善Thy1-ApoE4/C/EBPβ小鼠认知功能的下降（图4E-H）。

图4. #11A连续口服处理Thy1-ApoE4/C/EBPβ小鼠对神经元丢失和认知功能的影响

（图源：Z. Qian et al. NPP, 2023）

此外，研究人员还利用免疫染色和MRI成像等方法，分析了Thy1-ApoE4/C/EBPβ小鼠神经炎症水平以及脑体积的变化。研究结果表明，#11A连续处理能够显著降低星形胶质细胞和小胶质细胞的激活，并有效抑制小鼠脑体积的降低。综合上述结果表明：#11A连续口服给药处理对Thy1-ApoE4/C/EBPβ小鼠AD发生的症状具有明显治疗作用。

文章结论与讨论，启发与展望

AD作为一种最常见的神经退行性疾病，患病人数随着人口老龄化来临的日益加剧，将给社会和家庭带来严重的经济负担。然而，更残酷的现实是至今为止对AD病因和发病机制仍不十分明确，并且尚无有效的治疗方法，临床上使用的药物仅能轻度缓解AD的临床症状，但不能从根本上延缓或者阻断AD病理进程的发生。因此，研究AD的致病机制以及寻找新的靶点药物成为当前迫切需要解决的难题。
叶克强团队前期大量研究表明C/EBP/AEP信号通路是驱动包括AD在内的神经退行性疾病发生的关键因素，因此靶向该通路将可能是治疗AD的新方向。为此，研究团队筛选并优化获得特异性抑制AEP活性的小分子化合物#11A，并利用团队构建的全新的散发性AD小鼠模型开展本研究。结合口服以及静脉注射给药方式对#11A进行PK参数的表征，结果显示#11A具有较高的口服生物利用度和入脑效率；进一步利用家族遗传AD小鼠模型（APP/PS1, Tau P301S）以及散发性AD小鼠模型（Thy1-ApoE4/C/EBPβ小鼠）急性口服#11A给药处理发现，#11A能够显著抑制AEP酶活及其下游酶切底物产生的蛋白片段。因此，通过PK/PD的研究表明#11A具有较好的成药性，能够特异的靶向抑制AEP活性。利用Thy1-ApoE4/C/EBPβ小鼠进行连续口服#11A给药处理，分析#11A是否对AD的发生发展具有治疗作用。本研究的结果表明，#11A能够有效抑制A和Tau蛋白的病理特征，降低神经炎症以及神经细胞的丢失，从而延缓了大脑的萎缩以及认知功能的降低。
尽管本研究在散发性AD小鼠模型中证明了#11A具有较好的AD治疗效果及潜在的临床应用价值，但相关化合物结构的优化和临床研究工作仍需要进一步开展。在后续工作中，叶克强教授将进一步优化#11A化合物，并与医院展开合作，推动靶向AEP活性治疗AD的小分子药物研发。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41386-023-01774-2

本文第一通讯作者为叶克强教授，深圳理工大学（筹）生命健康学院生物系主任，第二通讯作者为中国科学院深圳先进技术研究院罗茜研究员，本文第一作者是钱政江博士，中国科学院深圳先进技术研究院脑所副研究员。

叶克强 （左），罗茜 （中）钱政江 （右）

（照片提供自：叶克强/罗茜实验室）

转载须知：“逻辑神经科学”特邀稿件，且作者授权发布；本内容著作权归作者和“逻辑神经科学”共同所有；欢迎个人转发分享，未经授权禁止转载，违者必究。

     【神经环路主题系列】技能培训班【光遗传学与遗传编码钙探针和神经递质探针工作原理及应用】和【在体成像技术在神经科学研究的基础与应用】（第四期）。讲师 陈明（复旦大学研究员）、万金霞（北京大学博士后，合作导师李毓龙教授）；时间 2024年1月6-8日（周六至周一）；地点 南京。

【脑片膜片钳记录系统的操作和应用】（电生理）（第二期）。讲师 陈明（复旦大学研究员）、来滨（复旦大学研究员）；时间 2024年1月13-15日（周六至周一）；地点 上海。

“理论知识，操作技能，科研思维”

（点击标题阅读全文）

逻辑神经科学群：文献学习2

扫码添加微信，并备注：逻辑-文献-姓名-单位-研究领域-学位/职称（注：不按要求格式备注，则不通过好友申请）

参考文献 
1. Sims JR, Zimmer JA, Evans CD, Lu M, Ardayfio P, Sparks J, et al. Donanemab in Early Symptomatic Alzheimer Disease: The TRAILBLAZER-ALZ 2 Randomized Clinical Trial. Jama. 2023;330(6):512-27.2. Cummings J, Zhou Y, Lee G, Zhong K, Fonseca J, and Cheng F. Alzheimer's disease drug development pipeline: 2023. Alzheimer's & dementia (New York, N Y). 2023;9(2):e12385.3. Zhang Z, Tian Y, and Ye K. δ-secretase in neurodegenerative diseases: mechanisms, regulators and therapeutic opportunities. Translational neurodegeneration. 2020;9:1.4. Zhang Z, Obianyo O, Dall E, Du Y, Fu H, Liu X, et al. Inhibition of delta-secretase improves cognitive functions in mouse models of Alzheimer's disease. Nature communications. 2017;8:14740.5. Lei K, Kang SS, Ahn EH, Chen C, Liao J, Liu X, et al. C/EBPβ/AEP Signaling Regulates the Oxidative Stress in Malignant Cancers, Stimulating the Metastasis. Molecular cancer therapeutics. 2021;20(9):1640-52.6. Xia Y, Wang ZH, Zhang J, Liu X, Yu SP, Ye KX, et al. C/EBPβ is a key transcription factor for APOE and preferentially mediates ApoE4 expression in Alzheimer's disease. Molecular psychiatry. 2021;26(10):6002-22.7. Wang ZH, Xia Y, Liu P, Liu X, Edgington-Mitchell L, Lei K, et al. ApoE4 activates C/EBPβ/δ-secretase with 27-hydroxycholesterol, driving the pathogenesis of Alzheimer's disease. Progress in neurobiology. 2021;202:102032.8. Wang ZH, Xia Y, Wu Z, Kang SS, Zhang JC, Liu P, et al. Neuronal ApoE4 stimulates C/EBPβ activation, promoting Alzheimer's disease pathology in a mouse model. Progress in neurobiology. 2022;209:102212.9. Qian Z, Li B, Meng X, Liao J, Wang G, Li Y, et al. Inhibition of asparagine endopeptidase (AEP) effectively treats sporadic Alzheimer’s disease in mice.
编辑︱王思珍本文完