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好家伙,蛋白条带也玩出抖音效果了......

The following article is from 聊点学术 Author Mark


Western blot是个很考验耐心和动手能力的实验。


曾经有位师弟说:“做完WB后,感觉整个人都成熟了”。



其实,做WB之前最好能够先熟悉原理,然后才可能在实操过程中发现问题和校正流程。不同实验室的条件不同,因此WB跑胶、转膜条件并不是普适的,必须根据具体情况进行调整,切忌刻舟求剑。


曾经有几位朋友咨询,说为啥自己的条带是弯的。看完,我立马想到这个动图了,哈哈......




条带发弯不是小问题,会让造成maker指示不准、误切目标条带、分析困难以及上图不美观等。因此,有必要就这个问题做出分析。


1. 凝胶问题


尽管现在已经有商用预制胶了,但大多数实验室还是没丢掉传统手艺,自己配胶。WB凝胶上部为浓缩胶,下部为分离胶。一般是等待分离胶充分凝固后,再缓慢倒入浓缩胶,最后插上梳子。


制胶架不在水平位置上或分离胶未充分凝固就急于灌入浓缩胶,是导致条带整体变弯或倾斜的重要原因。



(图片均来自网络)


如果你默认自己配的胶没问题,在后续切割凝胶时还是按照水平角度切,那么极可能将自己的目标调点给切掉。实验直接失败。


2. 凝胶中有泡泡


在配制凝胶时,将小烧杯放在实验操作台上轻轻摇晃达到溶解目的。绝对不要搅拌溶液,否则凝胶灌入玻璃板后会形成很多小泡泡。大的泡泡可以用滤纸吸破,但肉眼难以发现一些小泡泡。


这些小泡会形成一个窝坑。跑胶时,蛋白难以绕过这个坑,会形成弯弯扭扭的形状。当然,这种情况也可能是玻璃板没洗干净,以前的老渣滓拦住蛋白了。



3. 上样孔问题


合格的上样孔应该是底部水平的。但如果梳子不干净就用或者冲洗上样孔,则会造成条带畸形。


假如你上完样品后,发现蛋白样品在上样孔底部并不均匀整齐,那说明这个上样孔不太干净,此时已难以补救了。


所以,最好的办法是一开始就避免发生。配完胶,插梳子之前检查一下梳子有没有洗干净,确认无既往残渣后再插。上样前,轻轻拔下梳子,用加样枪吸取缓冲液轻轻冲洗上样孔,将上样孔内残留的凝胶碎屑冲掉。


4. 跑胶电压问题


电压过高是导致条带呈现“笑脸”的最主要原因。


通电后,凝胶中会形成一个大致“U”型的电场。电压越小,U型越平;电压越大,U型越陡。



所以有些人在做WB时,追求快,想要减少跑胶时间,往往会将电压调到很大,那么蛋白会在强电场作用下形成笑脸状。一个典型的表现就是,如果电压很大,跑胶时会看到左右两侧的maker向中部倾斜。


尤其是在做大分子量蛋白时,凝胶浓度较低,蛋白条带更容易受到强电场作用影响而变倾斜。


因此,菌菌推荐大家在跑胶时要耐心,不要追求大电压,而是根据实验室经验调至合适大小。否则后期分析条带时就会出现如下尴尬场景,这样的图用到论文中也是不太美观的。



Ending




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