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生物小白的入门必修课——细胞培养
The following article is from 轲小基的魔药教室 Author 柯基不会飞
一、单层贴壁细胞的细胞换液
确保细胞符合冻存标准—— a) 外观健康,形态学特征良好; b) 处于生长对数期; c) 无污染。 准备冻存管,每瓶细胞准备一支冻存管(冻存液配比=600μl培养基:300μl血清:100μl DMSO)。 胰酶消化,转移至离心管,准备离心 离心时,可加适量血清(5~10%); 离心完成后,去除上清液,使用1200ul培养基吹匀离心管内细胞; 离心管内加入600μl血清,小心吹匀,减少气泡产生; 逐滴加入DMSO共200μl(DMSO溶于水时大量放热,避免局部过热导致细胞热损伤),小心吹若干下,混匀液体; 转移细胞悬液进入冻存管,1ml/管,共2管; 冻存管梯度冷冻——4℃ 0.5h;-20℃ 2h冻存至固态;-80℃冰箱或液氮罐口(亦为-80℃)过夜,第二日再将冻存管没入液氮。或使用梯度冻存盒,常温下放入盒中,移入-80冰箱过夜,次日没入液氮。
液氮罐中取出冻存管,确认冻存管标签,37℃水浴,避免水没过管帽,持续摇动, 1分钟内即可融化。(注意液氮中取出后,避免长时间暴露于常温,或令其缓慢回温,此举可致细胞死亡率严重增加)。 冻存管内细胞悬液转移入离心管,以5ml/min(通常冻存管为2ml体系,则在半分钟左右再加入2ml培养基)的速度缓慢加入培养基,开始时逐滴加入,随后可渐加快,逐步稀释细胞和DMSO。 一定转速离心10min,去上清液; 培养基重新悬浮细胞沉淀,接种细胞至培养瓶; 24h后观察并确认细胞贴壁; 定期更换培养液,直至细胞系重新建立。
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