PNAS︱周正洪课题组解析水疱性口炎病毒聚合酶复合物的原位结构

撰文︱司   竹 

责编︱王思珍

非分段负链（nonsegmented negative-strand，NNS）RNA病毒是一类高度多样化的真核病毒，其中包括一些重要的人类病原体，例如狂犬病毒、麻疹病毒、尼帕病毒和埃博拉病毒。我们对这些病毒的转录和复制的分子机制的了解主要来自对水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）的研究。与其他NNS RNA病毒成员不同，VSV通常被认为是有益的。由于其本身的特性，如缺乏将病毒基因组整合到宿主细胞DNA中的能力、其基因组能够容纳多个外来基因片段插入、强大的体内免疫反应、快速复制以及高病毒产量等，VSV被广泛应用于抗癌治疗和疫苗开发的载体[1]。在这些以VSV为代表的NNS RNA病毒中，病毒基因组的转录和复制依赖于RNA依赖性的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）复合物。该复合物由聚合酶蛋白（L）和磷酸化蛋白（P）组成：L是一种多功能酶，用于进行RNA聚合以及与转录和复制相关的所有其他步骤，而P是其辅助因子，以调节L的功能和构象。尽管之前的关于纯化VSV聚合酶复合物的研究已经解析了其原子分辨率的结构[2, 3]，然而，VSV聚合酶复合物在每个病毒粒子内部的数目、位置以及与其他病毒蛋白的连接方式均是未知的。这限制了我们对VSV乃至其他NNS RNA病毒的转录和复制机制的探索，也同时阻碍了对这种广泛使用的抗癌和疫苗载体的设计工作。

2022年4月27日，加州大学洛杉矶分校周正洪教授课题组在PNAS上发表了题为“Locations and in situ structure of the polymerase complex inside the virion of vesicular stomatitis virus”的研究。该研究通过使用冷冻电子断层成像（cryoET）技术，结合子断层扫描图平均化（subtomogram averaging）和三维分类，揭示了VSV聚合酶复合物在子弹形病毒衣壳腔内与核衣壳蛋白（N）的连接以及其原位结构，并基于此提出了在病毒组装过程中聚合酶复合物的包装以及病毒入侵初期转录中聚合酶复合物的快速响应机制。

子弹形的VSV病毒粒子只包含一条负义单链RNA，从3’到5’端，按顺序编码了五个病毒蛋白：N、P、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和L。L是一个多结构域蛋白，在NNS RNA病毒中高度保守，和辅助因子P组成病毒的聚合酶复合物，被包装到病毒衣壳腔中。转录是VSV入侵细胞后复制周期的第一个生物合成事件，这些与病毒核衣壳一起进入宿主细胞的聚合酶复合物会在任何病毒蛋白合成前，直接用于初级转录。在转录过程中，模板是被N包被着的RNA链而并非裸露的RNA；L并不直接结合到模板，而是以P为纽带，P可以同时结合L和N-RNA。通常来说，VSV会在入侵宿主细胞后，迅速复制，甚至阻塞细胞核孔，迫使宿主细胞只翻译病毒mRNA。早期的扫描电镜研究表明，每个病毒粒子内部有大约50个L和400个P [4]，但是近几年前的利用超高分辨光学成像的研究报道L的拷贝数在20到70之间[5]。除去这些差异，目前还没有任何关于L和P是如何组装到成熟的病毒粒子中以及它们在病毒内腔的位置的明确信息，极大地限制了我们对VSV组装及复制机制的探索。

为了直接观察VSV病毒粒子的三维结构，研究人员对纯化的VSV进行cryoET成像，并对重构后的三维断层扫描图片降噪处理。结果清楚的显示了完整的子弹形病毒粒子有区别明显的尖端和底部，通体被膜包被，膜外装饰有多个三聚体G，膜内则是成左手螺旋结构的核衣壳。同时，核衣壳内并非空腔，而是分布了一些环形的蛋白，紧密连接在N的内侧（图1）。依据这些蛋白的大小及形状，它们被认为是L。

图1 一个完整的VSV病毒粒子的截面以及紧密连接在N的内侧的L

（图源：Si Z, et al., PNAS, 2022）

为了获取L的位置，研究人员首先聚焦在被L结合的核衣壳上。为了简化数据处理过程，只有更加规则的主干部分被考虑。之前的报道的结构显示VSV的主干部分包含两个共轴的左手螺旋，一层有N组成，另一层由M组成。这两个螺旋共享螺旋参数：每个螺旋圈有37.5个不对称单元[6]。然而，在收集到的三维断层扫描中，研究人员发现主干部分的直径并不相同，暗示了不同的病毒粒子拥有不同的螺旋参数。通过对所收集到的183个VSV病毒粒子依据每个螺旋圈的不对称单元数目进行分类，最终发现近半数的病毒粒子是由每个螺旋圈包含38.5个不对称单元堆积成的左手螺旋。进一步对这一类的病毒粒子主干的N和M进行定位，对齐和平均，最终得到了VSV M-N的子断层平均结构，分辨率为7.5Å（图2）。这个结构清晰的展示出两层M，而并非之前报道中的一层M，分布在N的外侧。通过将已有的N和M的晶体结构模型叠加到该子断层平均化结构中，进一步确认了N与M的化学计量比是1﹕2。该平均结构不仅完善了VSV核衣壳的构造，也为准确定位L提供了一个很好的平台。

图2 VSV M、N以及RNA的子断层平均结构的三维渲染

（图源：Si Z, et al., PNAS, 2022）

在VSV M-N的平均密度图中，研究人员观察到一层厚度大约为7nm的模糊层紧挨着N的内侧，这更加暗示了L的位置。通过对先前对齐好的子断层扫描图进一步分类，将包含有L连接的N与没有L连接的N分开，最终分出大约4.5%的子断层扫描图包含L。再对这些子断层扫描图进行平均，得到了全局分辨率大约为11Å的平均密度图 （图3）。由于在每个病毒中，N有1240个拷贝，研究人员估计L的拷贝数为55个。在对L的局部平均中，研究人员观察到了L和P的更多结构上的细节，然而，原先清晰的M和N的结构却被模糊，表明了每个L分子关于N的相对取向的不同，也暗示了L与N之间的柔性而松散的相互作用。进一步探索聚合酶复合物与N之间的相互作用及位点，研究人员将L的局部平均结构重建与M-N的亚纳米分辨率结构重建结合，并将L和P已有的原子结构模型叠加到该平均密度中发现，L的加帽结构域（capping domain）通过两处明显的密度与相邻的两个N相连；同时L上方的两个特征不明显的球形密度，被认为是P的二聚体，衔接了L的连接结构域（connector domain）和C端结构域（C-terminal domain）与来自另一个螺旋圈的两个N。通过这样的连接方式，L通过其辅助因子P与N相连，随机地分布在VSV核衣壳的内腔中。

图3 与N柔性连接的VSV聚合酶复合物的子断层平均结构密度图及三维渲染

（注：请将手机顺时针横屏或将图顺时针旋转90度或点击放大阅读此图信息）

（图源：Si Z, et al., PNAS, 2022）

图4 聚合酶复合物在成熟VSV病毒粒子中以及向转录起始端运动的模型

（图源：Si Z, et al., PNAS, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

回顾全文，作者通过冷冻电子断层成像技术，解析出VSV聚合酶复合物的原位结构，及其与核衣壳的相互作用关系：L与其辅助因子P，通过一种柔性且松散的结合方式，与附近的N连接，而被包装到成熟的病毒粒子中，并随机分布于内腔（图4）。同时估计每个病毒粒子中包含约55个聚合酶复合物。通过结合已有的蛋白原子结构模型，对聚合酶复合物的子断层扫描图平均重建结构的进一步分析表明，L通过加帽结构域与相邻的两个N结合，而P二聚体衔接了N与L的连接和C端结构域。这为病毒组装过程中L通过P被招募到N以及L与N之间的柔性连接提供了结构基础。L与N的这种相互作用，确保了所有的L在病毒内部有着相似的取向，暗示了它们在转录开始时朝着基因组3’端（转录起始端）的定向运动。在病毒入侵宿主细胞后，核衣壳从包膜中被释放，所有的聚合酶复合物依然通过P与N相连。在基因组3’端对L的高亲和力的驱动下，L被多个P二聚体像接力一样，一直传递到3’端，以启动初级转录（图4）。对于该动态过程在宿主细胞内部的直接观察，还需要进一步的细胞水平或动物体内研究。

原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2111948119

通讯作者周正洪教授（左），第一作者司竹博士（右）

（照片提供自：加州大学洛杉矶分校周正洪课题组）

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参考文献（上下滑动阅读）  

1.Majid AM, Barber GN. Recombinant Vesicular Stomatitis Virus (VSV) and Other Strategies in HCV Vaccine Designs and Immunotherapy. In: Tan SL, editor. Hepatitis C Viruses: Genomes and Molecular Biology. Norfolk (UK)2006.

2.Liang B, Li Z, Jenni S, Rahmeh AA, Morin BM, Grant T, et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 2015;162(2):314-27. Epub 2015/07/07. doi: 10.1016/j.cell.2015.06.018. PubMed PMID: 26144317; PubMed Central PMCID: PMCPMC4557768.

3.Jenni S, Bloyet LM, Diaz-Avalos R, Liang B, Whelan SPJ, Grigorieff N, et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Rep. 2020;30(1):53-60 e5. Epub 2020/01/09. doi: 10.1016/j.celrep.2019.12.024. PubMed PMID: 31914397; PubMed Central PMCID: PMCPMC7049099.

4.Thomas D, Newcomb WW, Brown JC, Wall JS, Hainfeld JF, Trus BL, et al. Mass and molecular composition of vesicular stomatitis virus: a scanning transmission electron microscopy analysis. J Virol. 1985;54(2):598-607. Epub 1985/05/01. doi: 10.1128/jvi.54.2.598-607.1985. PubMed PMID: 2985822; PubMed Central PMCID: PMCPMC254833.

5.Hodges JA, Tang X, Landesman M, Ruedas JB, Ghimire A, Perrault J, et al. A Polymerase Super Complex within Vesicular Stomatitis Virus. Biophys J. 2013;104(2):415a. doi: 10.1016/j.bpj.2012.11.2314.

6.Ge P, Tsao J, Schein S, Green TJ, Luo M, Zhou ZH. Cryo-EM model of the bullet-shaped vesicular stomatitis virus. Science. 2010;327(5966):689-93. Epub 2010/02/06. doi: 10.1126/science.1181766. PubMed PMID: 20133572; PubMed Central PMCID: PMCPMC2892700

制版︱王思珍

本文完