Nat Commun︱毛晓波/王文静团队合作发现纳米抗体有望治疗路易体痴呆

来源︱“岚翰生命科学”姊妹号“逻辑神经科学”

撰文︱刘雨青

编辑︱方以一

路易体痴呆（Lewy body dementia，LBD）是最常见的痴呆症之一[1]。大脑皮质中α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）的错误折叠和积累是LBD的重要病理特征。近期，一系列研究表明，α-syn是一种朊病毒类似蛋白，α-syn纤维能够诱导内源性α-syn单体错误折叠并聚集，并在细胞间和患者脑内传播，从而加重疾病的病理演化[2-4]。因此，特异性靶向α-syn纤维可能为治疗LBD提供一种有效的方法。

传统α-syn抗体由于体积大且结构复杂，通常仅能靶向细胞外的α-syn[5-7]。其在细胞质的还原环境中靶向性差，成本高昂等缺点也限制了传统抗体的使用。纳米抗体（Nanobody）作为单域抗体，具有稳定性高、尺寸小、渗透性强以及适合细胞内表达等优点[8, 9]。基于腺病毒（adeno-associated virus，AAV）的基因传递为长期疾病治疗中持续表达重组蛋白提供了一种有效的方法[10]。靶向总α-syn（单体和聚集体）的纳米抗体已被证实能够在体外和体内减少α-syn病理[11]。然而，靶向总α-syn的纳米抗体可能会干扰α-syn单体的正常生理功能。因此，迫切需要开发与α-syn聚集体特异性结合的纳米抗体用于疾病治疗。

2022年7月19日，约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所毛晓波（Xiaobo Mao）课题组与密歇根大学生命科学研究所王文静（Wenjing Wang）课题组合作在Nature Communications上发表了题为“α-Synuclein fibril-specific nanobody reduces prion-like α-synuclein spreading in mice”的研究。该研究设计了细胞外无二硫键纳米抗体库，获得了特异性结合α-syn纤维的纳米抗体。该纳米抗体可以促进α-syn纤维解离，抑制α-syn病理的脑内扩散，有望用于α-syn相关疾病的机制研究和治疗策略开发。

纳米抗体通常在细胞外氧化条件下进行筛选，在传统的纳米抗体支架中，两个保守的半胱氨酸残基在氧化条件下（例如，内质网、高尔基体、细胞外环境等）形成二硫键，而还原条件下（如细胞质），二硫键可能会被破坏，从而导致纳米抗体的稳定性、折叠和功能发生变化。因此，本文作者通过诱变两个保守的半胱氨酸残基设计了去除二硫键的纳米抗体库，用于筛选细胞内应用的纳米抗体（图1）。利用该纳米抗体库，作者对优先结合α-syn纤维而非单体的纳米抗体进行筛选，获得了28个克隆。

图1 针对α-syn纤维的纳米抗体筛选

（图源：Yemima R. Butler,et al., Nat Commun, 2022）

作者进一步通过体外表征验证了纳米抗体的选择特异性，并筛选出特异性结合α-syn纤维的纳米抗体（PFFNB2）（图2a, b）。在细胞质中，也观察到PFFNB2与α-syn纤维的相互作用，表明细胞内表达的PFFNB2具有适当的折叠和功能（图2c）。此外，PFFNB2可以选择性地与小鼠脑裂解物中的α-syn聚集体结合（图2d）。

图2 PFFNB2与α-syn纤维结合的体外表征

（图源：Yemima R. Butler,et al., Nat Commun, 2022）

既然证实了PFFNB2可以特异性结合α-syn纤维，作者进一步评估了PFFNB2对α-syn聚集及纤维稳定性的影响。实验发现，PFFNB2不能影响α-syn单体的聚集，但可以促使α-syn纤维解离（图3a, b）。利用AAV转导使小鼠原代神经元表达PFFNB2，并加入α-syn纤维诱导细胞内α-syn病理，发现PFFNB2可以显著抑制α-syn纤维诱导的原代神经元内的α-syn病理（图3f, g）。

图3 PFFNB2在体外解离α-syn纤维并抑制α-syn病理

（图源：Yemima R. Butler, et al., Nat Commun, 2022）

为了探究小鼠脑内PFFNB2能否阻止α-syn病理的扩散，作者将编码PFFNB2的AAV注射至新生小鼠脑室内。小鼠成年后，PFFNB2主要在皮层区域表达。将α-syn纤维注射至小鼠纹状体内，以诱导α-syn病理扩散至皮层。研究发现，对照组中α-syn纤维注射一个月后，α-syn病理从纹状体扩散到皮层（图4）。相反，在注射编码PFFNB2的AAV的小鼠脑内，pS129 水平显著降低（图4），表明PFFNB2可以有效地阻止小鼠脑内病理性α-syn从纹状体扩散到皮层。

图4 PFFNB2在体内减少由α-syn纤维诱导的α-syn病理

（图源：Yemima R. Butler,et al., Nat Commun, 2022）

图5 PFFNB2在脑内的表达与α-syn纤维诱导的α-syn病理强度呈负相关

（图源：Yemima R. Butler,et al., Nat Commun, 2022）

通过进一步分析，在注射编码PFFNB2的AAV的小鼠脑皮层内，PFFNB2的表达与pS129的强度信号呈负相关，即PFFNB2表达越高，pS129的信号越低。而在AAV-GFP的对照组则不呈现相关性（图5）。

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究利用无二硫键纳米抗体库，筛选出了特异性结合α-突触核蛋白（α-syn）纤维的纳米抗体PFFNB2。该纳米抗体可以在体外促进α-syn纤维的解离，减少α-syn纤维诱导的原代神经元内的α-syn病理，抑制小鼠脑内α-syn病理的扩散。该研究证明了在细胞质中稳定表达的无二硫键纳米抗体用于靶向α-syn纤维而非单体的可行性。在具有α-syn病理传播的小鼠模型的特定大脑区域中表达PFFNB2 将能进一步评估其在疾病进展中的功能。PFFNB2有望应用于研究不同大脑区域的病理发展，并进一步应用于缓解行为和认知缺陷，用于治疗LBD和相关的α-突触核蛋白病。

值得注意的是，文章中针对纳米抗体PFFNB2对于缓解α-syn纤维所产生的行为学障碍（运动、意识）还没有数据支持，另外通过基因递送的纳米抗体在短期和长期表达中对于安全性的影响还需要进一步的研究。这些实验研究都将对于α-syn纤维的纳米抗体的临床实验具有指导意义。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-31787-2#Ack1

通讯作者Xiaobo Mao（左），通讯作者Wenjing Wang（右）

（照片提供自：Xiaobo Mao实验室和Wenjing Wang实验室）

通讯作者简介：（上下滑动阅读）  

毛晓波，研究帕金森氏病中聚集的α-synuclein传播和细胞毒性机制。2021年被约翰斯霍普金斯医学院，神经病学学院和细胞工程学院，聘为副教授。毛博士发表文章60余篇，代表作包括Science (2016, 2018), Nature Comm (2022), Nano Today (2021), PNAS (2021)等，总引用率3500+次，授权专利4项。共指导博后，博士，访问学者和学生50余人。研究方向：帕金森病，阿尔兹海默症，α-synuclein，tau，cell-to-cell transmission，受体。有意申请博后，访学，请联系[e-mail]. https://www.hopkinsmedicine.org/profiles/results/directory/profile/10003736/xiaobo-mao

王文静，密歇根大学（安娜堡校区）化学系与生命科学研究所助理教授。课题主要研究方向是应用蛋白质定向进化发展纳米抗体用于治疗老龄化疾病， 并发展下一代光控基因技术，用于记录和调控生物进程： 标记与研究特定活动中激活的神经细胞，研究神经调节的机理，研究老龄化疾病的病因。研究成果在Science, Nature Biotechnology, eLife, Nature Communication 等期刊有发表，并且申请了多项专利。有意申请博后，请联系 [e-mail].

http://www.lsi.umich.edu/labs/wenjing-wang-lab

https://twitter.com/wenjingwanglab?lang=en

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Dodel R, Csoti I, Ebersbach G, et al. Lewy Body Dementia and Parkinson's Disease with Dementia [J]. J Neurol, 2008, 255 Suppl 5: 39-47.

[2] Braak H, Braak E. Pathoanatomy of Parkinson's Disease [J]. J Neurol, 2000, 247 Suppl 2: II3-10.

[3] Braak H, Del Tredici K, Rub U, et al. Staging of Brain Pathology Related to Sporadic Parkinson's Disease [J]. Neurobiol Aging, 2003, 24(2): 197-211.

[4] Volpicelli-Daley L A, Luk K C, Patel T P, et al. Exogenous Alpha-Synuclein Fibrils Induce Lewy Body Pathology Leading to Synaptic Dysfunction and Neuron Death [J]. Neuron, 2011, 72(1): 57-71.

[5] Bae E J, Lee H J, Rockenstein E, et al. Antibody-Aided Clearance of Extracellular Alpha-Synuclein Prevents Cell-to-Cell Aggregate Transmission [J]. J Neurosci, 2012, 32(39): 13454-13469.

[6] Masliah E, Rockenstein E, Mante M, et al. Passive Immunization Reduces Behavioral and Neuropathological Deficits in an Alpha-Synuclein Transgenic Model of Lewy Body Disease [J]. PLoS One, 2011, 6(4): e19338.

[7] Games D, Valera E, Spencer B, et al. Reducing C-Terminal-Truncated Alpha-Synuclein by Immunotherapy Attenuates Neurodegeneration and Propagation in Parkinson's Disease-Like Models [J]. J Neurosci, 2014, 34(28): 9441-9454.

[8] Muyldermans S. Nanobodies: Natural Single-Domain Antibodies [J]. Annu Rev Biochem, 2013, 82: 775-797.

[9] Jank L, Pinto-Espinoza C, Duan Y, et al. Current Approaches and Future Perspectives for Nanobodies in Stroke Diagnostic and Therapy [J]. Antibodies (Basel), 2019, 8(1).

[10] Messer A, Joshi S N. Intrabodies as Neuroprotective Therapeutics [J]. Neurotherapeutics, 2013, 10(3): 447-458.

[11] Guilliams T, El-Turk F, Buell A K, et al. Nanobodies Raised against Monomeric Alpha-Synuclein Distinguish between Fibrils at Different Maturation Stages [J]. J Mol Biol, 2013, 425(14): 2397-2411.

本文完