Front Immunol︱姜春来/张勇团队发现肌内接种AS02佐剂呼吸道合胞病毒亚单位疫苗展现出更好的免疫效果和安全性

撰文︱卞丽君

责编︱王思珍，方以一

编辑︱方以一

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）感染是急性呼吸道疾病的常见原因，全球每年可导致数百万人住院治疗，是最重要的公共卫生负担之一。RSV感染可能发生在所有年龄段的人群中，严重时可危及婴幼儿、老年人和免疫功能低下成年人的生命。虽然许多候选疫苗正在研发中，但目前仍没有获得许可的RSV疫苗上市[1]。

目前处于临床阶段的疫苗中，基于融合前构象RSV-F蛋白的亚单位疫苗展现出较好的安全性和免疫效果。而亚单位疫苗由于抗原本身免疫原性低，通常需要加入佐剂。佐剂是与抗原同时或预先注射的非特异性免疫刺激物，具有增强机体对抗原的免疫反应、调节免疫偏向、节省抗原剂量、减少疫苗接种次数等作用[2]。在前期研究中，姜春来/张勇团队使用预融合RSV-F蛋白联合不同佐剂（Alhydrogel^®、MF59、AS03、AS02和乙二醇壳聚糖）免疫BALB/c小鼠，发现联合AS02佐剂的RSV-F亚单位疫苗可引发高且持久的中和抗体反应和强大的Th1免疫反应，并在RSV攻毒后提供有效保护[3]。

除佐剂外，接种途径等其他因素也可能影响疫苗的免疫原性和安全性，进而影响佐剂疫苗在临床转化中的效果[4]。目前批准的人用疫苗主要通过肌内（intramuscular injection，i.m.）和皮下途径接种（subcutaneous injection，s.c.）。肌肉内丰富的血管分布可实现免疫细胞的快速募集，因此肌内接种往往能提高疫苗免疫原性并减少注射部位的不良反应，常用于含佐剂疫苗。皮下接种的优势在于可允许较大的疫苗注射量，并保持相对均匀和缓慢的扩散速率，从而延长免疫反应。尽管一些研究已经证实了接种途径可以不同程度地影响疫苗效率和安全性，但尚未全面比较接种途径对含佐剂RSV-F亚单位疫苗的免疫原性和安全性的影响。

2022年7月22日，吉林大学生命科学学院艾滋病疫苗国家工程实验室姜春来/张勇团队在国际学术期刊Frontiers in Immunology上发表了题为“Intramuscular Inoculation of AS02-Adjuvanted Respiratory Syncytial Virus (RSV) F Subunit Vaccine Shows Better Efficiency and Safety Than Subcutaneous Inoculation in BALB/c Mice”的研究成果。该团队发现对于RSV佐剂疫苗，相比于皮下免疫，肌内免疫是增强免疫应答、节约抗原剂量、减少不良反应更具优势的接种途径，为RSV重组亚单位疫苗的设计和临床转化提供了重要参考信息。

为了探讨接种途径对不同佐剂RSV-F疫苗免疫原性的影响，在此研究中姜春来/张勇团队将预融合RSV-F抗原分别联合不同佐剂（Alhydrogel^®、MF59、AS03、AS02）间隔两周对BALB/c小鼠进行Prime-boost接种，在不同时间点采集小鼠血液（图1），检测血清中抗原特异性IgG抗体水平及RSV病毒中和（virus neutralization）抗体滴度。在疫苗接种或感染的早期阶段，初始B细胞可以通过脾脏或引流淋巴结的滤泡外反应快速分化为中等亲和力且短寿命的浆母细胞，产生早期保护性抗体，并在免疫或感染后的第5-7天达到峰值。研究者通过评价初次免疫后1周的抗体水平（图2A），发现使用相同的抗原剂量，无论佐剂如何，皮下接种在初免后1周诱导与肌内注射相似的抗原特异性IgG抗体水平，表明这两种途径可能具有相当的促进浆细胞形成的能力。然而，在加强免疫后2周，肌内注射引起IgG抗体和中和抗体水平高于对应的皮下免疫组，甚至与十倍抗原剂量加两倍佐剂剂量的皮下免疫水平相当，展现出一定的剂量节省的能力（图2B, C）。此外，结合抗体及中和抗体结果均表明，与接种途径相比，佐剂在调节浆母细胞和浆细胞的产生以及IgG抗体和中和抗体的产生方面更为关键。在不同的采样时间点及两种不同的接种途径，各种佐剂的佐剂效力均呈现出相同排序：AS02>AS03，MF59>AL（图2）。

图1 免疫接种、攻毒、取样时间表及分组方案

（图源：Bian LJ, et al., Front Immunol, 2022）

图2 疫苗免疫原性相关评价

（图源：Bian LJ, et al., Front Immunol, 2022）

初始CD4⁺ T细胞在抗原刺激后分化为Th1、Th2、Th17和滤泡辅助T细胞等不同功能亚群。Th1细胞主要分泌IFN-γ, IL-2等细胞因子，它们能促进Th1细胞的增殖，进而发挥细胞免疫效应，由IL-4等细胞因子诱导的Th2偏向的免疫反应则与RSV疾病相关的气道炎症有关。有效的RSV疫苗不仅需要高水平的RSV中和抗体，还需要诱导Th1型细胞免疫反应[5]。为了探究各佐剂疫苗诱导机体的免疫应答偏向，研究者采用了ELISA法（图3A-D）和ELISpot法（图3E）检测抗原刺激脾细胞分泌的细胞因子水平及分泌IFN-γ的T细胞数量。结果表明，无论佐剂类型如何，在相同抗原剂量下，肌内注射途径可能比皮下途径更能引发Th1偏向的免疫反应。然而与接种途径相比，佐剂是介导免疫类型偏向的更具决定性的因素。在所有佐剂中，基于角鲨烯的乳剂倾向于通过肌内途径诱导平衡的Th1 / Th2免疫反应，而只有AS02在通过皮下途径接种时也保持相同的趋势，如IgG1/IgG2a结果所示（图3F）。

图3 疫苗诱导机体免疫应答偏向相关评价

（图源：Bian LJ, et al., Front Immunol, 2022）

为了评估上述佐剂疫苗的保护能力，研究者在加强免疫后第3周进行RSV攻毒实验。攻毒后3天，PBS组的病毒载量最高，其次是RSV-F组。与PBS和RSV-F相比，佐剂疫苗免疫组的病毒滴度基本等于或略高于检测限，表明病毒有效清除（图4A）。肺部炎症是RSV感染的一项重要病理指标，研究者通过H&E和PAS染色法评估攻毒后小鼠肺部的炎症反应及粘液分泌情况（图4B-D）。结果显示，攻毒后3天所有佐剂疫苗均表现出不同程度的炎症，并在攻毒后5天有所缓解（除铝佐剂和AS02皮下注射组外）。值得注意的是，铝佐剂和AS02皮下注射组在攻毒后5天肺部炎症非但没有缓解，反而恶化，表现出更多的炎症细胞浸润、杯状细胞增殖及气道腔粘液分泌，这在对应的肌肉注射组中并没有观察到。为了探究肺部炎症加重原因，研究人员检测了攻毒后肺部活化的T细胞及其亚型的百分比（图4E），发现在AS02皮下免疫组小鼠的肺组织中更多的CD4⁺ T细胞而不是CD8⁺ T细胞被激活，并且在攻毒后的第5天，趋势更加明显，这可能意味着AS02佐剂皮下注射可能会诱导不需要的强烈的炎症性CD4⁺ T细胞反应。虽然轻微的局部炎症反应通常对于有效的免疫细胞募集和充分的抗原呈递是必不可少的，但过度炎症可引起严重的组织损伤。

图4 攻毒实验

（图源：Bian LJ, et al., Front Immunol, 2022）

最后研究者选择了7个指标：抗体响应速度、结合抗体水平、中和抗体水平、中和抗体持久性、IgG2a/IgG1比值、病毒清除能力、攻毒后肺部保护能力，归一化处理各指标数据，制作了雷达图（图5），用以综合评价各佐剂疫苗特性。其中，MF59和AS03在两种接种途径中显示出相似的特征，而肌内注射AS02佐剂RSV-F亚单位疫苗显示出比皮下接种更好的保护效果和安全性。

图5 各佐剂疫苗特性

（图源：Bian LJ, et al., Front Immunol, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究对比了肌内和皮下途径对各种RSV-F佐剂疫苗（Alhydrogel-、MF59-、AS03-和AS02-佐剂疫苗）的免疫反应和保护功效的影响。结果表明，尽管皮下注射可在初次疫苗接种后诱导更快更高的免疫反应，但在加强免疫后，与皮下注射相比，肌内注射在增强RSV佐剂疫苗的免疫原性方面更具有优势，且安全性更好，特别是对于联合AS02佐剂的RSV-F疫苗。此外，佐剂相对于接种途径来说是调节抗体产生和免疫应答偏向的更具决定性的因素。同时研究者指出，局部过度炎症反应与攻毒后肺组织保护失效之间的关系尚不清楚，需要进一步探究以说明其相关机制，包括检测细胞因子表达谱、肺部炎症的持久性及其对肺功能的可能影响。除此之外，研究者表示仍需要进一步评价RSV-F特异性细胞免疫应答，CD4+ T细胞的功能亚群及攻毒后肺组织驻留记忆T细胞，以探索佐剂RSV-F疫苗的保护机制。

原文链接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.938598/full

姜春来教授、张勇副教授为本文通讯作者，博士生卞丽君为论文第一作者，团队其他成员及合作者均为本研究做出了重要贡献。

第一作者：卞丽君（第二排右1），通讯作者：张勇（第二排右5）

（照片提供自：吉林大学生命科学学院艾滋病疫苗国家工程实验室制剂组）

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[1] SHANG Z, TAN S, MA D. Respiratory syncytial virus: from pathogenesis to potential therapeutic strategies [J]. Int J Biol Sci, 2021, 17(14): 4073-91.

[2] APOSTóLICO J D S, LUNARDELLI V A S, COIRADA F C, et al. Adjuvants: Classification, Modus Operandi, and Licensing [J]. Journal of Immunology Research, 2016, 2016: 1459394.

[3] ZHENG Y, BIAN L, ZHAO H, et al. Respiratory Syncytial Virus F Subunit Vaccine With AS02 Adjuvant Elicits Balanced, Robust Humoral and Cellular Immunity in BALB/c Mice [J]. Frontiers in immunology, 2020, 11: 2265.

[4] BOBBALA S, HOOK S. Is There an Optimal Formulation and Delivery Strategy for Subunit Vaccines? [J]. Pharm Res, 2016, 33(9): 2078-97.

[5] SOTO J A, STEPHENS L M, WALDSTEIN K A, et al. Current Insights in the Development of Efficacious Vaccines Against RSV [J]. Frontiers in immunology, 2020, 11: 1507.

本文完