STAR Protocols︱贾琼团队发表二维和三维细胞外基质刚性调控及致瘤细胞筛选方案
撰文︱张娟，哈文韬
责编︱方以一，王思珍
编辑︱方以一
肿瘤物理微环境在肿瘤发生、进展、转移和治疗中的作用越来越受到重视。随着肿瘤的生长，它们会通过物理和生化机制破坏周围组织的结构和功能,由此产生的异常又会通过影响癌细胞及其微环境，助长肿瘤发生和治疗抗性。目前肿瘤力学讨论到的生物力学异常包括肿瘤固体应力、间质液压力、细胞外基质刚性和组织微结构等变化[1]。而二维（2D）及三维（3D）细胞外基质刚性调控肿瘤细胞干性及转移水平[2-4]。
2020年7月20日，南京医科大学附属南京医院贾琼/魏晓为课题组，联合香港理工大学谭又华教授在Cell旗下的STAR Protocols杂志在线发表了题为“Tumorigenic cell selection and substrate rigidity manipulation using 2D and 3D extracellular matrices”的研究方案论文（Protocol）。该研究方案论文为STAR Protocols期刊邀稿。旨在向广大科研工作者分享细胞外基质刚性操控的关键技术及其在肿瘤研究中的延伸应用方案。3D纤维蛋白（fibrin）软胶筛选致瘤细胞研究源于谭又华教授在2012年发表于Nature Materials的开创性研究结果[5]；2022年2月，贾琼/魏晓为课题组发表于Cell Reports的学术论文进一步推进了细胞外基质胶在肿瘤干性及转移研究中的应用[4]。基于此，该研究方案论文详细描述了2D丙烯酰胺（PA）和3D fibrin细胞外基质胶制备、基质刚性操控和致瘤细胞筛选等方法，作者还示范了两种基质胶在机械力信号转导研究的应用。
在这一工作中，作者绘制了制备2D和3D细胞外基质胶、克隆生长监测、细胞提取及后续应用的具体步骤（图1）。这些方法是在已发表的方法和作者的前期研究基础上总结出来的，具有很高的可操作性和可重复性。
在3D fibrin细胞外基质胶的实验流程中，作者使用相应配比的T7 Buffer、肿瘤细胞和Salmon Fibrinogen混合制成细胞悬液，再与Salmon Thrombin混合制作出生长在3D fibrin胶中的肿瘤克隆，经培育及相关实验条件处理后使用Dispase II溶解基质胶，离心提取克隆后即可用于后续Western Blot和qPCR等实验, 对单细胞有要求的实验可进一步使用TrypLE分散克隆。
而在2D PA细胞外基质胶的实验流程中，作者首先使用氢氧化钠、硅烷和戊二醛活化培养皿，而后配制不同比例（可实现不同的硬度需求）的丙烯酰胺、双丙烯酰胺、10%APS和TEMED制成贴在培养皿上的2D PA胶，再将Collagen Type I与2D PA胶交联激活并接种肿瘤细胞，经培育及相关实验条件处理后使用TrypLE消化，离心提取细胞后即可进行后续实验。
图1 二维和三维细胞外基质胶制备及应用步骤
（图源：Zhang et al., STAR Protocols, 2022）
一般情况下，实验者通过培训可以在两周内掌握凝胶生成的制作方法，并在1-2个月内掌握使用这两种凝胶应用于机械力信号转导研究的基本流程。作者还对这两种细胞外基质胶在体外研究中的应用问题进行了分析。由于3D fibrin胶的硬度取决于纤维蛋白原的浓度，因此可变范围较窄。此外，3D fibrin胶的结构不够稳定，在培养6-8 天后会发生降解，不能很好地应用于长期体外培养实验。另一方面，PA胶不适合3D模型，因为它们的成分对细胞有毒。研究者通常同时使用这两种方法进行实验，以确保研究的准确性。寻找具有更稳定机械性能的体外类器官模型可能是未来的重要研究方向。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.xpro.2022.101577
南京医科大学附属南京医院（南京市第一医院）肿瘤内科贾琼副研究员为本文的通讯作者。研究生张娟和哈文韬为文章的共同第一作者及技术通讯。该研究得到了国家自然科学基金委和江苏省自然科学基金委的经费支持。
通讯作者：贾琼（左一）， 第一作者：张娟（左二）、哈文韬（右一）
（照片提供自：贾琼实验室）
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参考文献（上下滑动阅读）
[1] Liu, J., Tan, Y., Zhang, H., Zhang, Y., Xu, P., Chen, J., Poh, Y.C., Tang, K., Wang, N., Huang, B. (2012). Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nature Mater 11, 734–741. 10.1038/nmat3361.
[2] Tan, Y., et al., Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature communications, 2014. 5: p. 4619.
[3] Jia, Q., et al., Downregulation of YAP-dependent Nupr1 promotes tumor-repopulating cell growth in soft matrices. Oncogenesis, 2016. 5: p. e220.
[4] Chang, Y., et al., Substrate rigidity dictates colorectal tumorigenic cell stemness and metastasis via CRAD-dependent mechanotransduction. Cell reports, 2022. 38(7): p. 110390.
[5] Nia, H.T., Munn, L.L., Jain, R.K. (2020). Physical traits of cancer. Science 370, eaaz0868. 10.1126/science.aaz0868.
本文完